張微， 李志新， 趙雪， 張金鵬， 付春江， 劉衛(wèi)平， 于倩倩

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，黑龍江 齊齊哈爾 161600）

馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）也叫馬鈴薯輕花葉病毒，馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）也叫馬鈴薯重花葉病毒，馬鈴薯 S病毒（potato virus S，PVS）也叫做馬鈴薯潛隱病毒，3種病毒主要通過接觸和蚜蟲傳播。3種病毒分布范圍十分廣泛，主要發(fā)生在馬鈴薯種植區(qū)，在田間3種病毒經(jīng)?；旌锨秩?，造成嚴(yán)重危害[1-3]。目前，馬鈴薯感染病毒后主要通過電子顯微鏡、DASELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）和PCR（polymerase chain reaction）等方法[4-6]進(jìn)行檢測，但此類方法只能在實驗室進(jìn)行，在生產(chǎn)應(yīng)用中具有很大局限性[7]。膠體金免疫層析技術(shù)（gold immune-chromatography assay，GICA）是將膠體金標(biāo)記、免疫檢測、層析分析、單（多）克隆抗體和新材料等結(jié)合在一起的技術(shù)，具有使用方便、反應(yīng)快捷、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)[8]，目前主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗、動植物疫病檢疫防控和食品安全監(jiān)督管理等方面[9-12]。在馬鈴薯病毒檢測上，已研制出PVX、PVY和PVS單重膠體金檢測試紙條[13-14]。而馬鈴薯被多種病毒同時侵染時一般使用PCR方法進(jìn)行檢測[15]。目前，關(guān)于多重病毒膠體金檢測試紙條的研究尚未見報道。為此，本研究欲研制一種可同時快速定性檢測PVX、PVY和PVS的多重膠體金試紙條，以期為馬鈴薯病毒病的檢測提供一種快速方便的方法，為馬鈴薯病毒病的田間鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為克新13號。PVX、PVY為本實驗室從馬鈴薯上分離得到；PVS、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）和馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）為本實驗室保存。將病毒分別摩擦接種繁殖于心葉煙（Nicotiana glutinosa）上。PVX、PVY和PVS抗體均購自美國Agdia公司；兔抗羊抗體購于北京百奧萊博科技有限公司；氯金酸購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白購自哈爾濱欣科瑞有限公司；硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC 膜）、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水紙、支持板、三維大平面點(diǎn)膜噴金儀、裁條機(jī)、微電腦自動斬切機(jī)均購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；DAS-ELISA檢測試劑盒購買于美國Agida公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 膠體金的制備、鑒定

采用氯金酸?檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，具體方法參見文獻(xiàn)[14]。

1.3 免疫膠體金試紙條制備工藝優(yōu)化

對于多種病毒同時檢測試紙條制備技術(shù)，在金標(biāo)抗體結(jié)合過程中，如將3種病毒抗體同時加入到膠體金溶液中，不同抗體之間會產(chǎn)生相互作用，且每種抗體與膠體金結(jié)合的條件存在差異，因此，需要對反應(yīng)過程進(jìn)行優(yōu)化。本研究主要針對反應(yīng)液pH、3種抗體的標(biāo)記量、抗體加入先后順序、封閉時間、離心時間、復(fù)溶液用量進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1 3種抗體與膠體金反應(yīng)pH優(yōu)化 取8支干凈的1.5 mL離心管，分別加入1 mL膠體金，然后分別加入5μL 1 mg·mL-1PVX、PVY和PVS抗體，再加入0.2 mol·L-1碳酸鉀（K2CO3）1、2、3、4、5、6、7和8μL調(diào)節(jié)pH,混勻后室溫震蕩反應(yīng)30 min，觀察不同pH反應(yīng)顏色變化，確定K2CO3的最適加入量，每處理3次重復(fù)。

1.3.2 3種抗體使用量的優(yōu)化 取8支干凈的1.5 mL離心管，分別加入1 mL膠體金和1.3.1確定的適量 K2CO3（0.2 mol·L-1），再分別加入 1 mg·mL-1PVX、PVY和PVS抗體1、2、3、4、5、6、7和8 μL，調(diào)節(jié)抗體標(biāo)記量,混勻后室溫震蕩反應(yīng)30 min，觀察不同抗體加入量時沉淀變化，確定免疫膠體金的最適抗體標(biāo)記量，每處理3次重復(fù)。

1.3.3 抗體加入順序優(yōu)化 取6支干凈的1.5 mL離心管，分別加入1 mL膠體金和適量K2CO3（0.2 mol·L-1），再分別按照 PVX-PVY-PVS、PVX-PVSPVY、PVY-PVX-PVS、PVY-PVS-PVX、PVS-PVXPVY和PVS-PVY-PVX順序分別加入1 mg·mL-13種最適抗體加入量。混勻后室溫震蕩反應(yīng)30 min，觀察顏色變化。根據(jù)顏色變化確定3種抗體加入先后順序，每個處理3次重復(fù)。

1.3.4 封閉時間與離心時間的優(yōu)化 按照1.3.1～1.3.3篩選的最適條件進(jìn)行標(biāo)記的金標(biāo)抗體中加入10%BSA，先設(shè)置封閉時間分別為20、25、30、35、40、45和50 min，離心30 min；再設(shè)置封閉30 min，離心時間分別為 20、25、30、35、40、45和 50 min。離心后，觀察上清與沉淀量的關(guān)系，確定最佳封閉時間與離心時間，每處理3次重復(fù)。

1.3.5 復(fù)溶液使用量的優(yōu)化 金標(biāo)抗體按照最佳封閉時間與離心時間離心后，留沉淀棄上清，分別用80、90、100、110和120μL的復(fù)溶液對沉淀進(jìn)行復(fù)溶。用噴金儀器設(shè)置合適的噴金量，噴在玻璃纖維紙上，制作金標(biāo)墊，根據(jù)質(zhì)控線的顏色確定復(fù)溶液的最佳用量，每處理3次重復(fù)。

1.4 檢測線和質(zhì)控線

將PVX、PVY和PVS抗體分別用超濾管（millipore，10 kD）濃縮至1.0 mg·mL-1，將NC膜固定貼合于支持板上，使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀，將3種抗體劃線于NC膜上，作為檢測線（testline，T線），其中，T1線為PVX檢測線；T2線為PVY檢測線；T3線為PVS檢測線。用0.02 mol·L-1磷酸緩沖液（phosphatic buffer solution，PBS，pH 7.4）將羊抗兔抗體稀釋至1.0 mg·mL-1，劃線于硝酸纖維素膜上，作為質(zhì)控線（controlline，C線），37℃烘4 h。

1.5 試紙條的組裝

將樣品墊、金標(biāo)墊和吸水紙組裝到附有NC膜的支持板上，然后用切條機(jī)切割成3.5 mm寬度的試紙條。

1.6 試紙條的質(zhì)量檢測

1.6.1 特異性檢測 利用PLRV、PVA、PVM、PVS、PVY、PVX以及PVX、PVY和PVS 3種病毒混合液對試紙條的特異性進(jìn)行檢測；將以上每種病毒的陽性材料用 2 mL的 PBS（0.02 mol·L-1）緩沖液混勻，制成樣品檢測液，將制備好的試紙條置于樣品液中檢測，重復(fù)檢測3次。

1.6.2 靈敏度檢測 取初始濃度為1 mg·mL-1的PVX、PVY和PVS陽性混合樣品進(jìn)行倍比稀釋獲得 1、2、10、20、102、2×102、103、2×103和104倍樣品稀釋液，用以檢測試紙條的靈敏度。

1.6.3 準(zhǔn)確性檢測 取馬鈴薯待檢樣品54份，分別采用膠體金試紙條和DAS-ELISA進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。DAS-ELISA方法具體如下：①包被抗體，酶聯(lián)板用1∶1 000稀釋倍數(shù)的病毒特異性抗體（Ig G)包被，包被液由碳酸鈉和碳酸氫鈉組成，每個酶聯(lián)板的小孔加入150μL的包被液，酶聯(lián)板置于37℃溫箱中溫育3～4 h；②洗板，用洗瓶在每個孔中加滿洗滌液，3 min后棄去洗滌液，重復(fù)洗滌8次；③加樣，將待測樣品稱重編號后放入研缽，在研缽內(nèi)加入樣品提取緩沖液（0.2 g樣品加入l mL緩沖液），取每個樣品150μL上清液加入酶聯(lián)板，同時設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照，放入4℃冰箱內(nèi)過夜；④加酶標(biāo)，在洗滌后的酶聯(lián)板中加入150μL酶標(biāo)抗體，37℃溫育3～4 h；⑤加底物液，在洗滌后的酶聯(lián)板中加入100μL底物液，進(jìn)行顯色反應(yīng)；⑥測OD值，將酶聯(lián)板放入酶聯(lián)免疫檢測儀中測定OD值。

1.6.4 穩(wěn)定性測試 將三重病毒檢測試紙條置于鋁箔袋中，加入干燥劑，每袋1條，一共180條，將其均分為3份。1份熱合封口后保存于2～6℃低溫環(huán)境中；1份熱合封口后保存于室溫；1份不封口保存于室溫；分別對以上保存條件設(shè)置保存12個月，每個月檢測試紙條有效性。

1.7 透射電鏡觀察膠體金形態(tài)

滴一滴膠體金溶液于銅網(wǎng)上，室溫吸附15 min，然后用0.1%的PBS洗5次，吸去余液，再用磷鎢酸負(fù)染5 min，干燥后置于透射電鏡（HT7700，日本）下觀察膠體金形態(tài)。

2 結(jié)果分析

2.1 膠體金顆粒

本試驗使用的膠體金最大吸收值在520～530 nm處（圖1），其顆粒形狀為球型或橢球型，直徑大小20～30 nm（圖2）。

圖1 膠體金吸收光譜Fig.1 Colloidal gold absorption spectrum

圖2 透射電鏡下膠體金顆粒形態(tài)Fig.2 Colloidal gold particle morphology under transmission electron microscope

2.2 膠體金試紙條制備條件的優(yōu)化

在節(jié)約耗材的基礎(chǔ)上，為達(dá)到理想的顯色效果，經(jīng)過試驗，制備金標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)條件為：加入0.2 mol·L-1K2CO33μL調(diào)節(jié)pH，金標(biāo)抗體混合液顏色為紅色；抗體加入量為4μL，此時仍沒有沉淀；按照PVY、PVX和PVS的先后順序加入效果最好，金標(biāo)抗體混合液顏色為紅色；最適封閉時間為30 min，離心時間40 min，金標(biāo)抗體混合液顏色由紅色轉(zhuǎn)為酒紅色，吸取上清時沉淀不易懸浮；最佳復(fù)溶液使用量為100μL，復(fù)溶沉淀噴金后，試紙條顯色為酒紅色，清晰可見（表1）。

表1 免疫膠體金試紙條制備工藝優(yōu)化Table 1 Optimization of preparation process of immune colloidal gold strip

2.3 試紙條的特異性

將試紙條分別插入PVS、PVY和PVX陽性樣品中，相應(yīng)病毒的檢測線及質(zhì)控線出現(xiàn)明顯條帶；3種病毒陽性樣品混合后，將試紙條插入混樣后，3條檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)清晰條帶；將試紙條分別插入PLRV、PVM、PVA的陽性樣品中，僅質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，表明三重病毒檢測試紙條具有高度特異性。（圖3）。

圖3 試紙條對6種常見病毒的特異性檢測Fig.3 Specific detection of 6 common viruses by strip

2.4 試紙條的靈敏度

分別將試紙條插入稀釋 1、2、10、20、102、2×102、103、2×103、104倍的PVX、PVY和PVS 3種病毒陽性樣品混合液中檢測試紙條的靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試紙條可檢測稀釋至104倍的PVX稀釋液、2×103倍 PVY 稀釋液和 103倍 PVS稀釋液（圖4）。

圖4 試紙條的靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity detection of test strips

2.5 試紙條準(zhǔn)確性

隨機(jī)從馬鈴薯種薯生產(chǎn)田間采集葉片54份，經(jīng)試紙條檢測，結(jié)果含有PVX的樣品為2份，含有PVY的樣品為3份，含PVS的樣品為7份，既含有PVY又含有PVS的樣品為2份，同時含有3種病毒的樣品為3份，37份為陰性，再用DAS-ELISA方法確認(rèn)，兩者結(jié)果一致（圖5）。

圖5 54份田間采集馬鈴薯樣品檢測Fig.5 Detection of 54 potato samples collected from the field

2.6 試紙條的穩(wěn)定性

圖6表明，三重病毒檢測試紙條在2～6℃環(huán)境中密封保存，有效期可達(dá)210 d；室溫密封保存，有效期大于120 d；室溫下敞開保存，有效期不足30 d。本試紙條適合在低溫環(huán)境下密封保存，可維持較好的穩(wěn)定性。

圖6 試紙條穩(wěn)定性測試Fig.6 Stability of test strip

3 討論

PVX、PVY和PVS為侵染馬鈴薯最常見的3種病毒，其中，PVX和PVS單獨(dú)侵染時危害較輕；PVY單獨(dú)侵染時危害較重。如果不進(jìn)行脫毒處理，病毒在馬鈴薯塊莖中積累會導(dǎo)致種薯逐年退化，產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。PVS是最難從馬鈴薯中脫除的病毒，且常與其他病毒復(fù)合侵染。2種以上不相關(guān)的病毒復(fù)合侵染同一寄主是病毒侵染過程中的常見現(xiàn)象。多種病毒復(fù)合侵染馬鈴薯危害會更加嚴(yán)重。研究表明，PVX與其他病毒復(fù)合侵染馬鈴薯造成的危害嚴(yán)重超過單一侵染的危害，對馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重威脅[1,16]，因此，開發(fā)對復(fù)合侵染病毒檢測的方法具有重要意義。研究表明，通過電鏡手段和PCR技術(shù)可以對PVX/PVY/PVS復(fù)合侵染進(jìn)行檢測[17-18]，但只能在實驗室開展。為了實現(xiàn)能夠在田間對PVX/PVY/PVS復(fù)合侵染同時快速檢測的目標(biāo)，本研究通過優(yōu)化制備條件，研制出了同時快速檢測PVX/PVY/PVS的三重病毒檢測試紙條。經(jīng)過田間取樣測試，三重病毒檢測試紙條與DAS-ELISA檢測結(jié)果完全一致。研究表明，單一檢測PVX或PVY的試紙條在檢測樣品時反應(yīng)時間約為10 min，試紙條的靈敏度分別為104倍（W/V）和103倍[13]；單一檢測PVS試紙條檢測樣品的反應(yīng)時間約為2 min[14]，靈敏度為104倍（W/V）[14]。一般情況下，多重病毒檢測試紙條的靈敏度會低于單一病毒檢測試紙條。本研究開發(fā)的三重病毒試紙條檢測樣品時間為5 min左右，反應(yīng)快捷；且靈敏度與單一檢測試紙條基本保持一致，說明本試紙條的制備技術(shù)較為先進(jìn)。三重病毒檢測試紙條在馬鈴薯田間使用時更為高效，1個試紙條可以同時實現(xiàn)檢測3種病毒；在制備成本上較單一檢測試紙條更節(jié)約耗材；且檢測結(jié)果能夠滿足田間及口岸一線的檢測要求，為馬鈴薯病毒病的檢測提供了一種快速方便的方法。