蘇煜， 黃劭理

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128；2.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，南寧 530001）

烤煙為葉用經(jīng)濟作物，其煙葉品質(zhì)的優(yōu)劣直接決定了經(jīng)濟效益的高低，因此應給予煙葉生長所需的充足養(yǎng)分?；瘜W肥料雖釋效快，但養(yǎng)分易流失，長期大量施用會引發(fā)水質(zhì)污染、土壤酸化板結(jié)和土傳病害等生態(tài)問題［1-3］，繼而對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。有機肥不僅能有效改良土壤肥力、活化土壤養(yǎng)分、提高土壤相關(guān)酶活力、克服土壤連作障礙，還可降低土傳病害的發(fā)生［4-6］?；逝c生物有機肥的合理配施能夠有效培肥土壤，協(xié)調(diào)煙葉化學成分，改良品質(zhì)［7］，彌補施用單一肥料的缺陷。大量研究報道了生物有機肥對烤煙根際土壤微生物的影響：張云偉等［8］研究表明，增施生物有機肥能提高烤煙根際土壤微生物數(shù)量和碳源利用強度，明顯改變烤煙根際微生物的群落功能；趙蘭鳳等［9］認為，生物有機肥可以增加根際土壤微生物活性；黃玥［10］研究也表明，生物有機肥可以增加烤煙根際細菌和放線菌的數(shù)量，但對真菌無顯著影響。有關(guān)生物有機肥和化肥配施的研究大多集中于對根際微生物的影響，而對烤煙葉片光合特性的研究鮮見報道。為此，本研究從烤煙的光合特性、土壤根際微生物數(shù)量和群落多樣性的角度進行分析，探究施用不同配比生物有機肥對煙葉光合特性和根際土壤微生物的作用機理。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2019年1—7月在湖南農(nóng)業(yè)大學中南煙草試驗站進行。土壤為沙質(zhì)壤土，前茬作物為水稻，土壤基本理化性狀為：有機質(zhì) 21.85 g·kg?1、堿解氮 126 mg·kg?1、速效磷 27.48 mg·kg?1、速效鉀 115.32 mg·kg?1、pH 6.2。供試品種為湘煙3號?；蕿闊煵輰Ｓ脧秃戏?，N、P2O5、K2O含量分別為14%、16%、15%，總養(yǎng)分≥45%。生物有機肥由湖南百田新型肥料化工有限公司提供，以動物糞便和植物秸稈為主要原料，含CSP3復合有益活性促生菌、內(nèi)合枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌等高效有益活性菌，其中，N、P2O5和K2O含量分別為0.8%、1%和4%，N-P2O5-K2O含量≥5%，有機質(zhì)含量≥45%，有益活菌數(shù)≥0.2億·g?1，氨基酸含量≥10%，腐植酸含量≥10%。

1.2 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置常規(guī)化肥處理（100%化肥，CK）、T1 處理（90%化肥+1 500 kg·hm?2生物有機肥）、T2處理（80%化肥+3 000 kg·hm?2生物有機肥）、T3處理（70%化肥+4 500 kg·hm?2生物有機肥）共4個處理。CK施氮量按120 kg·hm?2施入，T1、T2和T3處理化肥施氮量分別按108 kg·hm?2、96 kg·hm?2和 84 kg·hm?2施入。各處理均按照基肥∶追肥為6∶4施入，總養(yǎng)分比為N∶P2O5∶K2O＝1∶1∶2.4。生物有機肥作基肥全施，N和K2O不足部分用硫酸銨和硫酸鉀補齊。每個處理3次重復，共12個小區(qū)。每個小區(qū)植煙50株，株行距為0.5 m×1.2 m，小區(qū)面積30 m2。田間管理按當?shù)爻Ｒ?guī)栽培措施進行。

1.3 取樣與指標測定

在烤煙旺長期（移栽后60 d）測定光合速率，選擇在天氣晴朗的上午11：00，采用Li-6400便攜式光合作用測定儀（美國LI-COR公司生產(chǎn)）從底部葉往上數(shù)選取煙株的第8片葉測定煙葉的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（stomataconductance，Gs）、胞 間 CO2濃 度（intercellular CO2concentration，Ci）和 蒸 騰 速 率（transpiration rate，Tr）；用便攜式SPAD儀（北京海天友誠科技有限公司生產(chǎn)）測定同一片煙葉的葉綠素SPAD值。同期（移栽后60 d），采用五點取樣法從每個小區(qū)選取5株生長較一致的煙株，通過抖土法采集根系土樣，用于測定根際土壤微生物數(shù)量和碳代謝特征。采用稀釋平板計數(shù)法對細菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）、真菌（馬丁式培養(yǎng)基）和放線菌（高氏一號培養(yǎng)基）的數(shù)量和多樣性進行分析［11］。不同碳源利用能力及代謝特征的測定采用BIOLOG ECO微平板法［12］，具體步驟如下：稱取5 g土樣置于高壓滅菌的三角瓶中，加入0.85%氯化鈉100 mL，封口，120 r·min?1振蕩30 min，冰浴中靜置2 min，取5 mL上清液至100 mL滅菌三角瓶中，加入45 mL無菌水，重復稀釋3次，制得1∶1 000的提取液，立即用于ELISA反應。將BIOLOG ECO平板預熱到25℃，用移液器取150μL提取液于各孔中，28℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 用BIOLOG 讀板儀測定吸光值（590 nm）［13］。用BIOLOG ECO平板每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）來表征土壤微生物對碳源的利用能力［14］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理和分析，用SPSS 17.0進行顯著性分析，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行主成分分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增施生物有機肥對烤煙光合特性的影響

葉綠素含量是衡量植物衰老程度的重要參數(shù)，與植物光合作用的進行密切相關(guān)。旺長期由于煙株體內(nèi)代謝旺盛，養(yǎng)分利用率高，促進了葉綠素的合成。增施生物有機肥處理的煙葉SPAD值均顯著高于對照，且生物有機肥配比越高，變化越明顯（表1）。凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）的變化趨勢較一致，各參數(shù)均呈現(xiàn)出隨生物有機肥配施量的增加而增大的趨勢（表1）。王通明等［15］認為，有機肥的施用能延緩煙株的衰老，提高煙葉合成淀粉的能力和葉片光能利用率。生物有機肥中含有豐富的有機質(zhì)和諸多有益菌種，能夠有效延緩葉綠素的降解速率，使得煙株的碳代謝強度得以增強，從而為葉綠素的生物合成提供更多的碳骨架和能量。

表1 不同生物有機肥處理下烤煙的光合特性Table 1 Photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco with different treatment of bio-organic fertilizer

2.2 生物有機肥對烤煙根際土壤微生態(tài)的影響

2.2.1 生物有機肥對微生物數(shù)量的影響 細菌、真菌、放線菌是土壤微生物中的主要菌類，具有氧化、硝化、氨化、固氮和硫化等功能，在土壤有機物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化過程中起主導作用［16］。表2表明，生物有機肥用量的增加促進了細菌、真菌和放線菌數(shù)量的增加，總體微生物數(shù)量呈現(xiàn)細菌＞放線菌＞真菌。各處理間的細菌數(shù)量存在顯著差異，表現(xiàn)為T3＞T2＞T1＞CK。相較于CK，T2和T3處理的真菌數(shù)量分別增長了15.6%和16.8%，但T1與CK處理間差異不顯著。施用生物有機肥顯著提高了根際放線菌數(shù)量，相較于CK，T1、T2和T3處理的放線菌數(shù)量分別增加了33.9%、72.4%和86.2%，表明施用生物有機肥有益于微生物的生長和繁殖，提升了根際土壤微生物的密度。

表2 不同生物有機肥用量下土壤微生物的數(shù)量Table 2 The amount of microorganism in soil with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.2 生物有機肥對土壤微生物碳代謝指紋的影響 碳源AWCD是單一碳源利用能力的重要參數(shù)，反映了土壤微生物活性，AWCD值與碳源利用能力呈正相關(guān)［17-18］。圖1表明，0～24 h內(nèi)土壤微生物活性較低；24～72 h區(qū)間內(nèi)微生物活性急速上升，碳源利用力增強；72～144 h內(nèi)，土壤微生物對碳源的利用能力仍在提升但增速逐漸放緩；144 h以后，AWCD值趨于平穩(wěn)。AWCD值隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大，表明土壤微生物對31種碳源利用能力在不斷增強，且不同處理AWCD值差異顯著，配施生物有機肥處理的AWCD值明顯高于CK處理。在生物有機肥的作用下，根際微生物活性增強，碳源利用強度和程度均得到提高。

圖1 不同生物有機肥用量下烤煙根際土壤微生物AWCD值動態(tài)變化Fig.1 AWCD value dynamics over incubation time in the rhizosphere of flue-cured tobacco with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.3 生物有機肥對微生物不同種類碳源利用強度的影響 將31種碳源分為糖類、氨基酸類、聚合類、酚類、胺類和羧酸類共6大類，不同施肥處理下土壤微生物對各類碳源的利用偏好存在差異。相較于CK，配施生物有機肥能夠不同程度地提高各類碳源的利用能力（圖2）。T3處理中，微生物對各類碳源的利用率皆高于其他處理，其中對糖類碳源的利用率較CK提高了291%。但T1、T2和T3處理間，生物有機肥施用量的差異并未對胺類碳源利用率的提升起到明顯作用；氨基酸類、酚類和羧酸類碳源的利用能力在T2和T3處理間也無顯著差異。由此表明，增施生物有機肥，碳源利用能力得到提高，達到一定值后，生物有機肥用量與碳源利用率的相關(guān)性降低，碳源利用力趨于穩(wěn)定。

圖2 根際土壤微生物對不同種類碳源的利用能力Fig.2 Utility for different types of carbon sources by rhizospheric microbes in soil with different amount of bio-organic fertilizer

2.2.4 不同碳源主成分分析 為探究配施不同用量的生物有機肥處理下土壤微生物群落對31種單一碳源的利用，提取4個主成分因子（表3），主成分1（PC1）可以解釋碳源利用64.705%的變異；主成分2（PC2）可以解釋14.544%；前兩個主成分的累計貢獻率達到79.249%。主成分3（PC3）和主成分4（PC4）的方差貢獻率較小，分別為9.996%和4.105%。

表3 主成分貢獻率Table 3 Contribution rate of principal component

PC1和PC2分析結(jié)果（表4）表明，對PC1貢獻較大的碳源有27個（載荷值＞0.6），羧酸類占22.58%、糖類占19.35%、氨基酸類占19.35%、聚合類占12.90%、酚類和胺類各占6.45%。糖類碳源中D-甘露醇、氨基酸類中L-天冬酰胺酸和羧酸類α-丁酮酸對PC1的載荷值較高；與PC2相關(guān)性較高的2個碳源（載荷值＞0.6）分別為糖類中的β-甲基 D-葡萄糖苷和 D，L-α-甘油。除 D，L-α-甘油和α-D-乳糖外，其他碳源與PC1的相關(guān)性皆高于PC2。

表4 主成分載荷值Table 4 Loading values of principal components

2.2.5 微生物群落多樣性分析 根據(jù)根際微生物AWCD動態(tài)變化和碳源利用總能力情況，選取144 h的平均吸光度數(shù)值來分析不同生物有機肥施用量下土壤微生物群落的多樣性差異。結(jié)果（表5）表明，Shannon豐富度指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh均勻度指數(shù)在生物有機肥處理下均有所升高，總體表現(xiàn)為T3＞T2＞T1＞CK，各生物有機肥處理與CK處理間均存在顯著差異。而T1、T2、T3處理間，Shannon和Simpson指數(shù)差異不顯著，表明生物有機肥的施用量對群落豐富度和優(yōu)勢度的提升無顯著影響。

表5 土壤微生物群落多樣性Table 5 The diversity of microbial community in soil

2.3 烤煙光合特性與土壤微生物部分參數(shù)關(guān)聯(lián)度分析

通過灰色關(guān)聯(lián)度分析，對施用生物有機肥下微生物與光合特征指數(shù)、微生物多樣性及碳源利用程度的關(guān)聯(lián)性進行探究，結(jié)果（表6）表明，與光合特性的表征參數(shù)葉綠素SPAD值、凈光合速率（Pn）以及微生物豐富度和優(yōu)勢度指數(shù)的關(guān)聯(lián)性表現(xiàn)為細菌＞放線菌＞真菌＞生物有機肥；與微生物均勻度和碳源利用能力關(guān)聯(lián)程度較大的參數(shù)是放線菌，關(guān)聯(lián)度較小的參數(shù)是生物有機肥。相較于生物有機肥，根際微生物與烤煙葉片光合性能、土壤微生物群落多樣性和碳源利用能力的關(guān)聯(lián)性更強。

表6 光合參數(shù)與土壤微生物多樣性的關(guān)聯(lián)度Table 6 Correlation between photosynthetic parameters and soil microbial diversity

3 討論

相較于單施化肥，配施生物有機肥后，烤煙葉片的光合能力增強，根際土壤微生物的菌群密度和活躍率增加，與張云偉等［20］的研究結(jié)果一致；土壤微生物的均勻度、優(yōu)勢度及群落豐度均得到提高，但生物有機肥的施用量對土壤微生物的多樣性無顯著影響。綜合各性狀的表現(xiàn)，70%化肥配施4 500 kg·hm?2生物有機肥處理效果最佳。

生物有機肥中含有大量的益菌群和有機質(zhì)，外源有益菌種和活性碳源的介入豐富了土壤中可利用的養(yǎng)分，在一定程度上活化了土壤微生物，同時也加劇了微生物間的營養(yǎng)競爭。相較于生物有機肥，根際微生物數(shù)量與煙葉中葉綠素SPAD值和光合速率的關(guān)聯(lián)性更強，有研究表明微生物對植株葉綠素熒光參數(shù)和有效光的利用產(chǎn)生提高效應［21-23］，由此說明微生物對煙葉光合性能的改善起到一定的調(diào)節(jié)作用。微生物中細菌對生物有機肥的增施最為敏感，這可能與供試肥料中主要功能菌為芽孢桿菌類細菌有關(guān)?？莶菅挎邨U菌等有益微生物能利用土壤中的有機質(zhì)，產(chǎn)生大量生長素和赤霉素等次級代謝物，促進了烤煙的生長發(fā)育，從而實現(xiàn)微觀效應向表觀參數(shù)優(yōu)化的轉(zhuǎn)變。且外源介入的細菌與本土細菌形成了共生增殖的關(guān)系，對土壤營養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化、供應能力及土壤肥力產(chǎn)生不同程度的影響。