楊 玲，周素芳，路月紅，王 莉

0 引 言

近年來，中國酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的發(fā)病率上升[1]。過量飲酒可導(dǎo)致ALD，并誘發(fā)廣泛的肝病變，從單純性脂肪變性進(jìn)展為脂肪性肝炎，再到肝纖維化、肝硬化,甚至肝癌。輕度ALD患者通常是無癥狀的，僅表現(xiàn)為一定程度的脂肪變性，戒酒后可逆轉(zhuǎn)；然而，對于嚴(yán)重程度的ALD患者和那些沒有實(shí)現(xiàn)戒酒的患者，迫切需要特效藥物治療[2]。ALD發(fā)病機(jī)制尚未明確，找到疾病進(jìn)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有重要意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對ALD發(fā)病機(jī)制提出了“腸-肝軸”學(xué)說和“二次打擊”學(xué)說，兩者關(guān)系密切?！澳c-肝軸”學(xué)說認(rèn)為腸損傷與肝損傷相互作用，腸道屏障破壞導(dǎo)致腸源性脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，激活肝Kupffer細(xì)胞等，釋放一系列炎癥介質(zhì)，造成肝損傷；同時，肝免疫損傷釋放的各種炎癥介質(zhì)通過體循環(huán)到達(dá)腸道，進(jìn)一步損傷腸屏障功能[3]。根據(jù)“二次打擊”學(xué)說，乙醇作為初次打擊通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)直接導(dǎo)致肝損傷[4]；“二次打擊”是乙醇誘導(dǎo)的腸道屏障損傷導(dǎo)致LPS入血，激活肝免疫系統(tǒng)并釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重肝損傷[5-7]。兩種學(xué)說在ALD發(fā)生、發(fā)展中的作用已日益受到重視[8-12], 成為目前研究的新趨勢。兩種理論均強(qiáng)調(diào)LPS入血造成肝免疫損傷及炎癥反應(yīng)是ALD發(fā)病的關(guān)鍵一步。本研究采用ALD大鼠模型，依據(jù)“腸-肝軸”學(xué)說和“二次打擊”學(xué)說，探討ALD疾病進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制，并揭示ALD治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，6周齡，由江蘇省南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK(蘇)2014-0001。大鼠飼養(yǎng)溫度為20～26 ℃，濕度控制在50%～60%，光照與黑暗交替(各12 h)，自由飲水及進(jìn)食。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器56%乙醇購自北京紅星釀酒股份有限公司；D-乳酸測試盒購自南京建成生物工程研究所(批號：A109-2)；二胺氧化酶(DAO)測試盒購自南京建成生物工程研究所，批號：A088-2；脂多糖(LPS)測試盒購自南京建成生物工程研究所(批號：A054)；Rat IL-1 ELISA Kit購自eBioscience Technology 公司(批號：100527031)； Rat TNF-αELISA Kit購自eBioscience Technology 公司(批號：100335038)； Rat IFNγ ELISA Kit購自eBioscience Technology 公司(批號：96-900-M109)；小腸黏膜 sIgA ELISA Kit購自eBioscience Technology 公司(批號：100235034)； 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測試盒購自長春匯力生物科技有限公司(批號：A002)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測試盒購自長春匯力生物科技有限公司(批號：A001)；Beyozol購自碧云天(批號：R0011)；AccuRT Genomic DNA Removal Kit購自abm(批號：G488)；oneScriptTMcDNA Synthesis Kit購自abm(批號：G234)；EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix-ROX abm MasterMix-ER購自abm(批號：MasterMix-ER)。

臺式高速離心機(jī)(SCILOGEX D2012)；實(shí)時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(天隆 TL988-IV)；PCR儀(SCILOGEX TC1000-G )；Thermo MK3酶標(biāo)儀(美國熱電公司)；TS-1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1 分組、造模及給藥將80只大鼠隨機(jī)分為正常組、ALD組、LPS阻斷組、TLR4阻斷組，每組20只。ALD組、LPS阻斷組、TLR4阻斷組均需要建立ALD動物模型,具體參照文獻(xiàn) [13]，采用乙醇混合液[56%乙醇5 g/(kg·d)、玉米油2 mL/(kg·d)、吡唑27.2 mg/(kg·d)]灌胃建立ALD大鼠模型，1次/d；正常組每天灌服等容量的蒸餾水1次。各組大鼠均自由飲水，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，連續(xù)12 周。在造模同時給藥，LPS阻斷組予MP12(5 mg/kg)靜脈注射，1次/周，連續(xù)12周；TLR4阻斷組予NBP2(500 μg/kg)皮下注射，1次/d，連續(xù)12周。末次給藥后大鼠禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量，腹主動脈采血，分離血清和血漿，-80 ℃保存；解剖后，提取腸系膜淋巴結(jié)、肝及小腸組織，-80 ℃保存。

1.3.2血清ALT、AST檢測全自動生化分析儀測血清ALT、AST水平，采取標(biāo)本后按全自動生化儀操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3.3血漿二胺氧化酶、D-乳酸、LPS檢測按照試劑盒說明書測定大鼠血漿二胺氧化酶、D-乳酸、LPS水平。

1.3.4小腸黏膜sIgA測定取完整小腸縱行剖開，反復(fù)沖洗腸腔，玻片輕刮腸腔表面,滴管定量吸取刮取物0.1 mL加入115 mL磷酸鹽緩沖溶液充分混勻，反復(fù)低溫離心后取上清，ELISA法檢測小腸黏膜sIgA。

1.3.5組織培養(yǎng)法檢測細(xì)菌易位取腸系膜淋巴結(jié)0.5 g，勻漿后作細(xì)菌培養(yǎng)。37 ℃孵育48 h，如果培養(yǎng)基平皿菌落數(shù)多于100個/g組織記為細(xì)菌培養(yǎng)陽性。

1.3.6血清TNF-α、IL-1和IFNγ檢測采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1 和 IFNγ含量，檢測操作嚴(yán)格遵從說明書執(zhí)行。

1.3.7RealtimeQ-PCR測TLR4、MyD88、TRIF、IKK、P38、IRF3、NF-κB基因表達(dá)取各組大鼠肝組織50 mg勻漿處理后，經(jīng)4 ℃，10000 r/min，離心10min，棄去上清。經(jīng)洗滌沉淀、充分溶解，提取總RNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以 cDNA產(chǎn)物為模板,用Real time Q-PCR 測TLR4、MyD88、TRIF、IKK、P38、IRF3、NF-κB基因表達(dá)。根據(jù)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s(重復(fù)40個循環(huán))，60 ℃退火及延伸30 min(重復(fù)40個循環(huán))；再于60～95 ℃，持續(xù)5 s，分析熔解曲線。采用軟件分析閾值與Ct值。

1.3.8Western印跡法測TLR4、MyD88、TRIF、IKK、P38、IRF3、NF-κB蛋白表達(dá)取-80 ℃凍存的肝組織50 mg勻漿，加400 μL單去污劑裂解液，充分裂解30 min后，在4 ℃下12000 r/min離心5 min，取上清液；提取細(xì)胞質(zhì)溶膠中總蛋白，BCA法對樣品蛋白質(zhì)定量。取蛋白樣品經(jīng)煮沸變性5 min、冰浴5 min后，進(jìn)行SDS變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上形成印跡，用含5%脫脂奶粉室溫?fù)u動封閉1 h。將膜置于含對應(yīng)一抗的Blotto中，4 ℃搖動過夜。TBST洗膜4次，每次5 min。加入含對應(yīng)二抗(HRP標(biāo)記兔抗鼠和羊抗兔IgG抗體) Blotto中，室溫作用1.5 h，再洗膜。將膜先后置于顯色劑、曝光盒后進(jìn)行顯影，用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像，分析各條帶亮度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血 ALT、AST 比較ALD組大鼠血中ALT、AST表達(dá)量較正常組、LPS阻斷組、TLR4阻斷組顯著升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血中 ALT、AST 水平比較

2.2各組大鼠血漿D-乳酸、LPS 和 DAO 的比較ALD組大鼠血漿D-乳酸、LPS和DAO較正常組、TLR4阻斷組顯著升高(P<0.05)，LPS阻斷組D-乳酸、DAO表達(dá)較ALD組顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血漿D-乳酸、LPS 和 DAO的比較

2.3各組大鼠小腸腸黏膜SIgA的比較ALD組大鼠小腸黏膜 SIgA[(168.67±18.38)pg/mL] 較正常組[(535.66±61.81)pg/mL]、TLR4 阻斷組[(478.18±42.30)pg/mL]顯著下降(P<0.01)，LPS 阻斷組大鼠小腸黏膜 SIgA [(303.65±129.64)pg/mL]較ALD組顯著升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌量檢出數(shù)的比較ALD組大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌量檢出數(shù)[(248±28)個]較正常組[(0±0)個]、LPS阻斷組[(25±8)個]、 TLR4 阻斷組 [(18±6)個]明顯升高(P<0.01)。

2.5各組大鼠血清 TNF-α、IL-1、IFNγ的比較ALD組大鼠血中炎癥因子TNF-α、IL-1表達(dá)較正常組、TLR4阻斷組顯著升高(P<0.01)， LPS阻斷組IL-1表達(dá)較ALD組明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清 TNF-α、IL-1、IFNγ比較

2.6各組大鼠肝組織TLR4、MyD88、IKK、P38、NF-κB、TRIF、IRF3基因表達(dá)ALD大鼠中TLR4、MyD88、IKK、P38、和NF-κB基因表達(dá)增強(qiáng)，予 LPS 和TLR4 阻斷劑后上述基因表達(dá)量受到抑制(P<0.05)；TRIF、IRF3基因各組差異不顯著。見圖1。

與ALD組比較，*P<0.05、**P<0.01

2.7各組大鼠肝組織TLR4、MyD88、IKK、P38、NF-κB、TRIF、IRF3蛋白表達(dá)ALD大鼠中 TLR4、MyD88、IKK、P38和 NF-κB 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，使用 LPS 和 TLR4 阻斷劑后上述蛋白表達(dá)量受到抑制；TRIF、IRF3 蛋白表達(dá)在各組間差異不顯著。見圖2。

1：正常組；2：ALD組；3：LPS 阻斷組；4：TLR4 阻斷組

3 討 論

ALD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種途徑。“腸-肝軸”學(xué)說認(rèn)為酒精性腸損傷與肝損傷相互作用[3]，形成一個自我延續(xù)的惡性循環(huán)?！岸未驌簟睂W(xué)說提出乙醇作為“初次打擊”直接導(dǎo)致肝損傷[4]，ALD的“二次打擊”是乙醇破壞腸道屏障使LPS入血引起的[5-7]。兩種理論關(guān)系密切，均強(qiáng)調(diào)LPS入血造成肝臟免疫損傷及炎癥反應(yīng)是ALD發(fā)病的關(guān)鍵一步。

乙醇影響腸道屏障的多層防御[14-16]，包括生理、體液和免疫成分[17]。酒精濫用破壞腸道屏障從而增加腸道通透性[18-19]，使大量腸道細(xì)菌產(chǎn)生的LPS得以進(jìn)入門靜脈循環(huán)[20-21]。進(jìn)入門靜脈血后，LPS被肝Kupffer細(xì)胞等細(xì)胞上表達(dá)的TLR4識別[22-23]。雖然TLR4不能直接與LPS結(jié)合，但其共同受體CD14和髓樣分化蛋白2與LPS結(jié)合，并在與LPS結(jié)合后激活TLR4[24]，啟動LPS/TLR4信號通路。LPS/TLR4信號通路的啟動導(dǎo)致銜接分子髓樣分化因子88(MyD88)和TRIF的募集，它們分別激活LPS/TLR4信號通路的兩條下游途徑，不同下游途徑產(chǎn)生不同的炎癥因子[25-26]。銜接蛋白MyD88承接MyD88依賴途徑，該通路被激活后，活化后的MyD88進(jìn)一步激活通路內(nèi)關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，經(jīng)過一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo),導(dǎo)致IKK磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB[27]?；罨腘F-κB轉(zhuǎn)位入核啟動炎癥因子基因表達(dá), 最終導(dǎo)致TNF-α、IL-1等炎癥因子釋放[28]。銜接蛋白TRIF聯(lián)接MyD88獨(dú)立途徑，該通路被激活后，隨即激活I(lǐng)RF3使其磷酸化[29]?；罨腎RF3調(diào)節(jié)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致IFN等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[30-31]。LPS/TLR4信號通路激活后產(chǎn)生大量炎癥因子，最終觸發(fā)肝內(nèi)炎癥反應(yīng)參與ALD的發(fā)病。

本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了ALD大鼠模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALD大鼠肝損傷與腸屏障損傷同時存在。酒精可致ALD大鼠肝損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞破壞，血清AST、ALT 升高。同時，酒精可致大鼠腸黏膜機(jī)械屏障損傷，表現(xiàn)為腸壁通透性增加，血漿D-乳酸、二胺氧化酶和LPS升高；酒精可致腸道免疫屏障損傷，表現(xiàn)為小腸黏膜分泌型 SIgA 減少；酒精可致腸道生物屏障損傷，腸道細(xì)菌易位，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌檢出數(shù)增加。腸道屏障損傷導(dǎo)致LPS入血激活LPS/TLR4信號通路，釋放炎癥因子，導(dǎo)致肝免疫性損傷。本實(shí)驗(yàn)中，ALD大鼠血中TNF-α、IL-1較正常組顯著性升高，TLR4、MyD88、IKK、P38和NF-κB基因和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而各組IFNγ無顯著性差異，TRIF、IRF3基因和蛋白表達(dá)各組差異不大，提示LPS/TLR4信號通路的下游途徑中MyD88依賴途徑參與了ALD發(fā)病的過程，MyD88獨(dú)立途徑可能沒有參與ALD的發(fā)病。當(dāng)給予ALD大鼠LPS阻斷劑(MP12)和TLR4阻斷劑(NBP2)后，結(jié)果顯示，兩種阻斷劑能有效地阻斷LPS/TLR4 信號通路，在相關(guān)因子TLR4、MyD88、IKK、NF-κB、TNF-α、IL-1表達(dá)減少的同時，ALD 大鼠的腸屏障及肝損傷均好轉(zhuǎn)，提示LPS/TLR4 信號通路高表達(dá)，相關(guān)因子TLR4、MyD88、IKK、NF-κB、TNF-α、IL-1表達(dá)或釋放，是酒精致腸屏障及肝臟損傷的重要機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)酒精損傷腸屏障，激活LPS/TLR4信號通路，導(dǎo)致肝免疫性損傷，是酒精性肝損傷的重要分子機(jī)制。同時，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，酒精導(dǎo)致腸屏障損傷，其直接損傷作用似乎并不嚴(yán)重，而由于直接損傷后導(dǎo)致 LPS/TLR4 信號通路表達(dá)增強(qiáng)， 介導(dǎo)腸屏障受到免疫性“二次打擊”，可能是腸屏障損傷更為重要的機(jī)制。腸屏障也如肝臟一樣，可受到“二次打擊”，并且“二次打擊”對腸屏障造成的損傷更為重要，腸屏障的“二次打擊”也同樣由LPS/TLR4信號通路所介導(dǎo)，這從另一角度豐富了“腸-肝軸”學(xué)說。

綜上所述，乙醇本身并不是ALD疾病進(jìn)展的唯一原因，ALD的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多層次的過程。本研究初步證實(shí)LPS/TLR4信號通路激活是ALD疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該信號通路可成為ALD治療的潛在靶點(diǎn)。但是,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路錯綜復(fù)雜，而目前研究涉及的指標(biāo)尚不能全面地反應(yīng)LPS/TLR4信號通路在ALD發(fā)病中的作用，其有關(guān)機(jī)制值得進(jìn)一步證實(shí)及深入研究。