楊 依，戴春秋，王正梅，王嘉琪，吳菲菲，張昆龍，高 楓，王亞云

0 引 言

鼠類與人類的基因非常相似，99%的鼠類基因與人類基因同源；且與猴和豬等實驗動物相比，鼠的繁殖速度快、喂養(yǎng)成本低，因此，鼠類已成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中重要的實驗對象。其中，C57BL/6J小鼠繁殖性穩(wěn)定，壽命較長，對腫瘤敏感性低，是國內(nèi)外最常用的鼠類實驗動物[1]。特別在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，基于C57BL/6J小鼠遺傳背景已經(jīng)成功建立數(shù)百種轉(zhuǎn)基因模式動物，并廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)以及臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制研究[2]。因此，精準(zhǔn)測量C57BL/6J小鼠神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)數(shù)據(jù)具有重要意義。

目前，基于C57BL/6J小鼠構(gòu)建脊髓損傷動物模型進(jìn)行相關(guān)研究已成為國內(nèi)外熱點前沿領(lǐng)域[3-6]。例如，Zhang等[7]利用微型切割機(jī)在不損傷脊髓背側(cè)動脈及其分支的情況下將脊髓右半切除來制作脊髓半切損傷模型，其重要步驟就是顯露第9-11胸椎(T9-11)棘突，然后確定第10胸椎(T10)脊髓部位，最后用骨鉗去除該部位椎板后，于中線切開硬腦膜暴露脊髓。Fan等[8]和Landry等[9]進(jìn)一步將上述小鼠脊髓損傷模型的制備與基因表達(dá)檢測研究相結(jié)合，以探索脊髓損傷時重要的分子和神經(jīng)機(jī)制。隨后，又誕生了改良Allen′s脊髓打孔法建立小鼠脊髓損傷動物模型。例如，Ito等[10]首先確定T10椎體部位，然后在該部位進(jìn)行手術(shù)切開并分離椎旁肌肉，顯露椎板后行T10節(jié)段椎板切除術(shù)，最后實現(xiàn)充分暴露脊髓組織的目的。由于脊柱作為實驗性脊髓損傷的一個標(biāo)志，且脊髓節(jié)段與相應(yīng)脊椎不完全對應(yīng)[11]。由此可見，明確C57BL/6J小鼠脊椎與脊髓的解剖位置關(guān)系及其表面標(biāo)志是成功建立小鼠脊髓損傷模型的基礎(chǔ)。

既往研究人員對小鼠脊椎及脊髓的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了極其深入的研究[12-16]，以2009年由Watson C和Harvey AR編撰的專著《The Mouse Nervous System》(愛思唯爾出版社最為經(jīng)典)[17]，迄今為止，該著作中有關(guān)小鼠脊椎和脊髓的數(shù)據(jù)仍然被全世界實驗室研究人員最常引用。但遺憾的是，這些數(shù)據(jù)亟需進(jìn)行補(bǔ)充完善和修訂。

本研究利用最新體視學(xué)測量法，重點研究了C57BL/6J小鼠脊椎和脊髓精細(xì)解剖學(xué)數(shù)據(jù)，并對脊椎與脊髓的節(jié)段對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)分析與比對。本研究結(jié)果說明活體捫及C57BL/6J小鼠背部胸段最隆起骨性結(jié)構(gòu)即為T1的棘突，捫及骨盆后與其平齊的椎骨即為第6腰椎(L6)，繼續(xù)向下捫及腰骶部最隆起骨性結(jié)構(gòu)即為第2骶椎(S2)棘突。本研究為精準(zhǔn)定位小鼠脊椎與脊髓不同節(jié)段提供了明確的實驗室數(shù)據(jù)，為更好研究神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供了重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物準(zhǔn)備本研究選用20只雄性C57BL/6 J小鼠(3月齡，空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)，體重約為(20.13±0.66) g。實驗動物合格證號：SCXK(陜)2019-001。實驗嚴(yán)格按照《實驗動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，報告均遵循ARRIVE指南。小鼠在濕度43%～ 48% 和溫度22～25 ℃環(huán)境中生長，12/12 h光/暗循環(huán)，可自由獲取食物和水。所有實驗程序均得到空軍軍醫(yī)大學(xué)(西安)研究教育動物使用與護(hù)理委員會的批準(zhǔn)，并在盡可能減輕動物痛苦的同時，犧牲最少數(shù)量的動物。

1.2 實驗步驟戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉小鼠，40 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS；pH=7.4)溶液灌流，70 mL 4%多聚甲醛溶液灌注并固定組織。固定后立即取出完整椎體，剝離表面肌肉并浸泡在4%多聚甲醛溶液中以避免脊髓收縮，保證脊椎和脊髓的完整性。分離脊髓時，從頸髓開始將椎板和椎體從上至下去除，取出整個脊髓并避免脊髓損傷。在熒光顯微鏡下觀察并立即測量(LEICA，M205RA)。為保證脊髓測量的準(zhǔn)確性，觀察時間不應(yīng)超過20 min。

1.3 測量范圍逐一測量脊椎和脊髓的頭端到尾端，觀察其生理曲率。在顯微鏡下測量頸椎、胸椎、腰椎和骶椎。測定小鼠脊髓各節(jié)段的長度和比例并確定脊椎腰骶部膨大的分布區(qū)域。

2 結(jié) 果

2.1 C57BL/6J小鼠的脊椎測量結(jié)果C57BL/6J小鼠有7個頸椎，第1頸椎(C1)較大。胸椎共13個，C57BL/6J小鼠第1胸椎(T1)背側(cè)(棘突)突起較明顯，在體外可觸及，該突起與第2肋骨相對應(yīng)。腰椎共6個，L6位于骨盆，L5-L6之間的椎間盤與大腿根部相對應(yīng)。骶椎有4個。見圖1。C57BL/6J小鼠椎體全長(57.34±2.93) mm，頸椎長度(7.61±0.51) mm，占椎體總長度13.28%±0.01%；胸椎長度(20.96±1.56) mm，占總長度的36.53%±0.53%，腰椎長度(17.74±0.62) mm，占椎體總長度的31.00%±0.21%；骶椎長度(11.03±0.94) mm，占椎體總長度的19.22 %± 0.32%。腰骶部可觸及較明顯隆起，該隆起對應(yīng)于S2。胸腰椎邊界在解剖過程中易被破壞斷開。

圖1 C57BL/6J小鼠的脊柱測量結(jié)果Figure 1 Skeletal vertebral columns of C57BL/6J (n=20) mice

2.2 C57BL/6J小鼠的脊髓測量結(jié)果C57BL/6J小鼠脊髓細(xì)長，近似圓柱形，白色，背腹側(cè)稍扁平，由中線隔分成左右兩半。從枕骨大孔后端延伸至脊椎下部。C57BL/6J小鼠脊髓由34個節(jié)段組成：8個頸段(C1-C8)、13個胸段(T1-T13)、6個腰段(L1-L6)和4個骶段(S1-S4)。C57BL/6J小鼠脊髓總長度約(43.94±2.77) mm，其中頸段脊髓長度為(7.61±0.51) mm，占脊髓總長度的16.91%±0.02%。胸段脊髓長度為16.91%±0.02%，占脊髓總長度的47.55%±0.02%。腰骶段脊髓長度為(15.67±2.01) mm，占脊髓總長度的(35.53±0.03)%。全脊髓有兩處膨大，頸部和腰部有兩處膨大，長度相對較短，其上部的頸段和胸段脊髓較長。即頸、腰(腰骶部)膨大，并與肢體神經(jīng)相連。頸膨大從C4/C5延伸至T1，長度范圍為(3.90±0.03) mm，寬度范圍為(2.41±0.03) mm。腰膨大從L1延伸至L5，長度范圍為(8.79±0.04 )mm，寬度范圍為(2.02±0.11) mm。腰膨大比頸膨大略窄，其背腹直徑也略小。見圖2。

圖2 C57BL/6J小鼠的脊髓測量結(jié)果Figure 2 Skeletal vertebral columns of C57BL/6J(n=20) mice

2.3 本研究數(shù)據(jù)與Yaksh的數(shù)據(jù)對比與既往研究相比[18]，本研究中，頸椎長度縮短了0.72%，胸椎長度延了1.53%，腰椎長度縮短了1.0%，骶椎長度延長了0.22%。見圖3。

圖3 與Yaksh的數(shù)據(jù)對比Figure 3 Comparison of the present sudy and data from Yaksh (1999)

2.4 C57BL/6J小鼠的脊椎與脊髓對應(yīng)關(guān)系T10以上脊髓與脊椎平行對應(yīng)，T10以下脊髓明顯短于脊椎。脊髓的起始點，即C1，與第1頸椎相對應(yīng)。脊髓末端，即S4，對應(yīng)于第4及第5腰椎。頸膨大，即C4/C5-T1，對應(yīng)于第5頸椎到第1胸椎。腰膨大，即L1-L5，對應(yīng)于第13胸椎到第3腰椎。脊髓終止的部位與第5腰椎相對應(yīng)。

3 討 論

C57BL/6J小鼠的顱骨和骶骨尾端之間共有25到30個椎體。一般來說，C57BL/6J小鼠有7個頸椎、13個胸椎、6個腰椎、4個骶椎和28個尾椎[12,19]。本研究結(jié)果與既往實驗結(jié)果一致。Green等[19]觀察到小鼠胸椎和腰椎的數(shù)量在不同品系間與同一品系內(nèi)都有顯著的差異。在Bagg白化小鼠中，Yaksh[18]觀察到13～14個胸椎和5～6個腰椎。幾乎所有大鼠都有6個腰椎，但Rigaud等[20]觀察到不同品系小鼠之間存在顯著差異——DBA/2J中有5個椎體，C57BL/6J中有6個椎體，B6129PF2/J小鼠的差異則更大。

除去尾椎，不同節(jié)段在小鼠脊柱總長度的占比約為頸椎14%，胸椎35%，腰椎32%，骶椎19%[18]。相比之下，本研究顯示C57BL/6J小鼠頸椎長度縮短了0.72%，胸椎長度延長了1.53%，腰椎長度縮短了1.0%，骶椎長度延長了0.22%。一般來說，小鼠的頸椎和腰椎活動度較高，但在本研究中發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠的頸椎和腰椎活動度均縮短，這表明小鼠的活動度降低。我們推測，這可能是由于近年來實驗鼠繁殖環(huán)境、飲食條件的改善，小鼠獲取食物更加方便，且采用單獨的籠式飼養(yǎng)，使小鼠活動范圍縮小，導(dǎo)致運動量減少。同時，在本實驗中，小鼠的脊椎總長度略有增加，說明小鼠呈現(xiàn)出長大的趨勢，充足的飲食條件和良好的飼養(yǎng)環(huán)境提供了較好的生長環(huán)境。由于脊髓整體比椎體短，只有大部分頭端脊髓節(jié)段與相應(yīng)椎體相對應(yīng)，且這種差異在頭端中有增加趨勢。從出生到成熟，這種差異也在增加。Sakla[21]研究了大鼠從出生后第1天到第120天脊髓和脊椎的生長情況，他觀察到脊椎比脊髓長得快，第1天脊髓止于相應(yīng)的第5骶椎，第120天脊髓下行至第5腰椎。文獻(xiàn)報道成年大鼠的脊椎比脊髓生長快，因此脊椎和脊髓并非一一對應(yīng)，且脊髓有兩處膨大，即頸、腰(腰骶部)膨大，膨大與相應(yīng)肢體的神經(jīng)相連接[21]。頸膨大從C5延伸到T1，腰膨大從L2延伸到L6。

然而，嚙齒類動物脊髓損傷模型的病理改變接近與人類脊髓損傷的臨床特征，主要表現(xiàn)為損傷部位彌漫性出血、壞死和水腫，若損傷時間較長，導(dǎo)致脊髓萎縮[22]?？梢?，明確嚙齒類動物脊柱以及脊髓的定位關(guān)系將是一個重點。近年來，小鼠廣泛應(yīng)用于外周神經(jīng)病變模型的制備，以促進(jìn)神經(jīng)病理性痛的研究[23]。因此，在小鼠脊髓損傷模型的制備過程中，缺乏準(zhǔn)確的脊髓解剖定位可能會一定程度限制影響實驗研究，進(jìn)而影響試驗后小鼠功能恢復(fù)或治療干預(yù)的療效評價。本研究對C57BL/6J小鼠脊椎和脊髓的解剖位置進(jìn)行了研究，準(zhǔn)確測量了每個節(jié)段相應(yīng)的長度和比例，以及棘突的明顯標(biāo)志物，頸膨大和腰骶膨大的部位，明確了小鼠脊髓與脊椎的對應(yīng)關(guān)系，便于準(zhǔn)確找到脊髓損傷模型制備與鞘內(nèi)注射的位置，為開展脊髓損傷及脊髓背角注射病毒小鼠模型的相關(guān)實驗提供了重要的解剖基礎(chǔ)，進(jìn)一步為脊髓相關(guān)疾病患者及臨床定位診斷奠定科研基礎(chǔ)。

雖然哺乳動物脊髓的大體結(jié)構(gòu)相似，但在神經(jīng)連接和神經(jīng)組織上仍存在一些差異，這使得研究小鼠脊髓十分必要。動物實驗?zāi)Ｐ团c臨床的病理環(huán)境尚有不同，即使同一種模型不同品系的動物所產(chǎn)生的脊髓損傷的效應(yīng)也不盡相同，然而不同的研究團(tuán)隊因具體的實驗需要，選用小鼠的品系和月齡并不一致。因此，在后續(xù)的實驗中，我們將進(jìn)一步研究不同種類的大鼠和其他小鼠的脊椎和脊髓的變化及其相互對應(yīng)關(guān)系。此外，我們還將進(jìn)一步研究C57BL/6J小鼠背根神經(jīng)的詳細(xì)數(shù)據(jù)。