熊文翠，杜 偉，李正亮，楊培鈺

0 引 言

據(jù) 《全球癌癥報(bào)告》記載，全球每年報(bào)告84.1萬(wàn)例肝細(xì)胞癌病例，其中約78.1萬(wàn)人死于肝細(xì)胞癌[1]。目前，手術(shù)切除仍是肝癌治療的首選，但80%以上的患者確診時(shí)已無(wú)法手術(shù)，5年生存率僅10%左右[2]。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞術(shù)(transcatheter arterial embolization,TAE)是無(wú)法手術(shù)治療的中晚期肝癌患者的首選，但其3年生存率僅有14%～30%，這與TAE術(shù)后腫瘤缺血缺氧并分泌大量促血管生成因子有關(guān)[3]，而新生血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)，故TAE術(shù)無(wú)法達(dá)到根治的效果。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前特異性最強(qiáng)的促血管生成因子，與腫瘤新生血管的生長(zhǎng)密切相關(guān)[4-5]，并能改變血管通透性，刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)增殖，影響肝癌患者的生存及預(yù)后。同時(shí)，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌TAE術(shù)后癌旁肝組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)表達(dá)下降，核因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)表達(dá)升高并促進(jìn)了炎性因子TNF-α、IL-10產(chǎn)生，加重了癌旁肝組織肝功能損傷[6-7]。PPARα來(lái)自核受體PPAR家族(PPARα，PPARδ和PPARγ)，是能量代謝的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在肝、腎和心臟等多個(gè)器官中表達(dá)，可調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)且對(duì)調(diào)節(jié)炎癥和血管生成起著重要作用[8]。匹立尼酸(Pirinixic acid, WY14643)是一種新型的人工合成PPARα激動(dòng)劑，能激活PPARα下調(diào)與免疫途徑相關(guān)的各種基因[9]，抑制炎癥反應(yīng)，緩解肝功能損傷。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)WY14643能下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制新生血管生成。NF-κB是細(xì)胞變性壞死及炎癥產(chǎn)生的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，能調(diào)控下游的炎性因子及黏附因子，推動(dòng)炎癥的進(jìn)展[11]。本研究擬通過(guò)觀察匹立尼酸預(yù)處理后的VX2肝癌模型兔癌旁肝組織中PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及腫瘤組織中VEGF水平變化，探討匹立尼酸保護(hù)癌旁組織肝功能及抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用，以期為肝癌患者TAE術(shù)后預(yù)后提供重要的臨床參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象選取VX2荷瘤兔2只(由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院惠贈(zèng))，70只健康新西蘭大白兔購(gòu)買(mǎi)于昆明楚商科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滇)K20180001，體重2.5～3.6 kg，雌雄不限，營(yíng)養(yǎng)狀況一致，普通飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照SPF級(jí)要求飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，換氣次數(shù)10～15次/h，空氣潔凈度10 000級(jí)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理方法通過(guò)傳代及瘤粒注射法構(gòu)建肝癌兔模型[6-7]，共成功建模60只，隨機(jī)分為：對(duì)照組(不作任何處理)、TAE組(僅行TAE術(shù))、聯(lián)合治療組[TAE術(shù)前3 d連續(xù)耳緣靜脈注射匹立尼酸(劑量：3 mg/kg·d)，后行TAE術(shù)]，每組20只。

1.3肝功能檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材與保存術(shù)前3 d及模型兔處死前分別抽取3組外周血，分離血清，分裝進(jìn)Eppendorf管(EP)做好標(biāo)記，部分用于檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，部分存于-20 ℃?zhèn)溆?，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。TAE術(shù)后3 d將實(shí)驗(yàn)兔處死，取其癌旁組織，參考“7點(diǎn)”基線(xiàn)取材法[12]，取距腫瘤邊緣>2 cm的癌旁肝組織，等滲鹽水漂洗，液氮速凍并做好標(biāo)記后存于-80℃冰箱備用。

1.4免疫組化法檢測(cè)PPARα及NF-κB表達(dá)水平癌旁組織固定后用石蠟包埋并切片，石蠟包埋標(biāo)本，切片后用免疫組化法檢測(cè)PPARα、NF-κB，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。由兩名病理醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估結(jié)果，取平均值。每張切片于400倍鏡下選取10個(gè)視野，依據(jù)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)比例和蛋白表達(dá)部位陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分。細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)比例計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%為0分， 5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，黃棕色為2分，深棕色為3分。將細(xì)胞陽(yáng)性評(píng)分和陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度評(píng)分之和，作為判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)為<2分，弱陽(yáng)性(+)為2～3分，陽(yáng)性(2+)為4～5分，強(qiáng)陽(yáng)性(3+)為6～7分[6]。

1.5 ELISA法檢測(cè)TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF蛋白水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)標(biāo)本中TNF-α、抗細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)及VEGF蛋白水平，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 RT-PCR檢測(cè)PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF mRNA 表達(dá)水平取各組模型兔適量組織制備各組癌旁肝組織勻漿，通過(guò)TRIzol法提取總mRNA，測(cè)定其光密度(A)值，計(jì)算出RNA純度和濃度，嚴(yán)格按照試劑盒實(shí)用說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR反應(yīng)，PPARα引物序列上下游分別為：5′-CACCATCCACTTCGAGCAGA-3′,3′-GTCACATTCCCAGGTCGCC-5′；NF-κB引物序列上下游分別為：5′-ACTTCCTGGCGCATCTAGTG-3′,3′-CATGTCCTTGGGTCCAGCAT-5′；TNF-α引物序列上下游分別為：5′-GGGTATCCTTTCGACGGCAA-3′,3′-GGCGTTTCCAAAGTACGTGG-5′；ICAM-1引物序列上下游分別為：5′-CAGATGGCTCCGTGATCACAG-3′,3′-ACCAGCTTTAGCCGAATCGTTC-5′；VCAM-1引物序列上下游分別為：5′-CAGACACGGTGGAGCAGATC-3′,3′-AAGACTACCAAGCCGCTGAC-5′；VEGF引物序列上下游分別為：5′-TGGACAAACCTGAGCCCTAAC-3′,3′-TCACTTTCTGCAGGCCAAGT-5′。擴(kuò)增條件：①95 ℃，10 min；②95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，25 s；40個(gè)循環(huán)；③72 ℃，5 min。采用相對(duì)定量法(2-△△CT法)分析mRNA的相對(duì)表達(dá)含量。

2 結(jié) 果

2.1 肝功能指標(biāo)ALT、AST變化水平3組模型兔間術(shù)前外周血中ALT、AST水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后聯(lián)合治療組ALT、AST水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，低于TAE組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 模型兔術(shù)前術(shù)后肝功能功能檢測(cè)比較

2.2免疫組化法檢測(cè)PPARα、NF-κB表達(dá)水平免疫組化分析顯示，PPARα在聯(lián)合治療組中陽(yáng)性率高于對(duì)照組、TAE組(P<0.05)；NF-κB在聯(lián)合治療組癌旁肝組織的陽(yáng)性率顯著低于TAE組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 癌旁肝組織中PPARα、NF-κB免疫組化結(jié)果

2.3ELISA法檢測(cè)TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF蛋白水平聯(lián)合治療組TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量顯著低于TAE組(P<0.05), TAE組TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF蛋白水平

2.4RT-PCR檢測(cè)PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF mRNA 表達(dá)水平聯(lián)合治療組PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量顯著低于TAE組(P<0.05), TAE組PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

*P<0.05

3 討 論

臨床上約90%行TAE治療的HCC患者已是中晚期并伴有不同程度的肝硬化，肝功能基本處于臨界值狀態(tài)[13]。本研究應(yīng)用了WY14643的聯(lián)合治療組ALT、AST水平低于TAE組，表明WY14643具有保護(hù)肝功能的作用，與前期結(jié)果相符。因此，如何盡可能在保護(hù)肝功能前提下完成腫瘤栓塞成為肝介入治療的重點(diǎn)。

本研究結(jié)果示，TAE術(shù)后肝癌組織中VEGF高于對(duì)照組及聯(lián)合治療組，與張國(guó)福[14]的結(jié)論相似；戴峰等[15]研究也提示TAE術(shù)后因不全栓塞、多側(cè)支循環(huán)等因素，造成腫瘤不能完全凋亡壞死，在缺氧環(huán)境誘導(dǎo)下局部腫瘤組織產(chǎn)生VEGF，刺激腫瘤血管快速生成并持續(xù)增殖。此外，VEGF結(jié)合癌細(xì)胞膜受體，降低細(xì)胞間質(zhì)黏附性，使癌栓分離脫落，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。Yao等[17]研究結(jié)果提示，HCC中高表達(dá)的VEGF與腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，故抑制腫瘤血管生成對(duì)改善患者預(yù)后有重要意義。另已有研究表明，PPARα激動(dòng)劑通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，上調(diào)內(nèi)皮抑素的表達(dá)來(lái)阻礙腫瘤血管的生成從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[18-19]；結(jié)合本研究結(jié)果，聯(lián)合治療組中VEGF水平顯著低于TAE組，由此推斷，WY14643能在一定程度上抑制腫瘤組織VEGF的表達(dá)，從而減少腫瘤新生血管，降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的幾率。

炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，炎性指標(biāo)在評(píng)估肝癌患者預(yù)后中有重要價(jià)值[20]。NF-κB是炎癥和新血管形成的主要轉(zhuǎn)錄因子；未受刺激時(shí)，NF-κB與其抑制蛋白IκB-α結(jié)合形成復(fù)合體，以無(wú)活性狀態(tài)儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)中，從而發(fā)揮抗炎作用[21]。TNF-α是一種多效性細(xì)胞因子，可激活NF-κB并促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的炎癥相關(guān)的抗凋亡因子轉(zhuǎn)錄[22]，從而產(chǎn)生炎癥。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)，NF-κB能促進(jìn)炎性因子表達(dá)，且NF-κB 和 TNF-α 之間的正反饋反應(yīng)似乎會(huì)加重炎癥和肝細(xì)胞損傷的程度。白細(xì)胞浸潤(rùn)是急性炎癥的標(biāo)志，主要由細(xì)胞黏附因子(如ICAM-1、VCAM-1等)介導(dǎo)[24]。Liang等[25]證實(shí)ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的表達(dá)可由NF-κB來(lái)介導(dǎo)，而高表達(dá)的黏附因子會(huì)增強(qiáng)炎癥細(xì)胞募集和黏附，加重炎癥損傷。另Jing等[26]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)下調(diào)NF-κB/TNF-α信號(hào)通路，減少炎性因子與黏附因子的表達(dá)，可保護(hù)細(xì)胞免受炎癥損傷，這表明NF-κB的活性變化及其下游調(diào)控因子的表達(dá)與癌旁組織肝損傷變化具有明顯的相關(guān)性。

Nakano等[27]及Tayyeb等[28]研究表明，PPARα 激動(dòng)劑可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié) NF-κB 活化來(lái)抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥基因的激活，如VCAM-1、TNF-α和IL-6；其次，PPARα 激動(dòng)劑還可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，降低氧化應(yīng)激，從而抑制NF-κB活化[29]。本研究結(jié)果顯示，TAE組中NF-κB活性增強(qiáng)，TNF-α和ICAM-1、VCAM-1水平上升，加速細(xì)胞凋亡壞死，導(dǎo)致肝功能損壞；而經(jīng)WY14643預(yù)處理后，NF-κB活性下降,TNF-α和ICAM-1、VCAM-1水平降低,減慢細(xì)胞凋亡壞死，緩解肝功能損傷，由此推測(cè)WY14643可通過(guò)活化PPARα，拮抗NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，減少下游炎癥基因表達(dá)，達(dá)到抗炎的目的。由此可見(jiàn)NF-κB與其下游的TNF-α、ICAM-1和VCAM-1之間是相互作用的，對(duì)于PPARα是否是通過(guò)抑制NF-κB表達(dá)來(lái)減少TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，還是PPARα分別對(duì)其有調(diào)節(jié)作用尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但至少本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)WY14643預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組中NF-κB、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1都不同程度下降，炎癥得到了緩解。

肝癌通常發(fā)生在肝炎、肝硬化等慢性肝損傷基礎(chǔ)上，慢性肝損傷引起的炎癥微環(huán)境會(huì)促進(jìn)肝硬化發(fā)展并激活癌旁組織中NF-κB、TNF-α等炎癥介質(zhì)，加速肝癌惡變[30-32]。結(jié)合本研究推測(cè)，WY14643可通過(guò)減輕肝損傷及炎癥，一定程度上延緩肝硬化發(fā)展，有助于患者的預(yù)后評(píng)估。

綜上所述，WY14643可通過(guò)上調(diào)PPARα表達(dá)，抑制NF-κB產(chǎn)生，減少TNF-α、ICAM-1和VCAM-1合成，從而減輕TAE術(shù)后癌旁肝組織炎癥，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)來(lái)遏制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，為改善TAE術(shù)后患者生存預(yù)后提供新的指導(dǎo)意見(jiàn)。但本次研究的相關(guān)因子較表淺，且WY14643抑制腫瘤血管生成和改善炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜，還需進(jìn)一步研究。