鐘春英 譚 茵 唐三淇 劉亞婷 武正軍*

(1.廣西師范大學(xué)，珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，桂林，541006；2.廣西師范大學(xué)，廣西珍稀瀕危動物生態(tài)重點實驗室，桂林，541006)

腸道是動物機體重要的消化吸收器官，其中棲息著一個數(shù)量龐大的微生物群落，稱為腸道微生物或腸道菌群[1]。據(jù)估計，成人腸道內(nèi)的微生物可達(dá)1012～1014數(shù)量級，遠(yuǎn)大于人體表面微生物和人體自身細(xì)胞數(shù)量[2]。腸道微生物極其多樣，具有獨特的功能特征，在宿主的免疫代謝[3-5]、營養(yǎng)吸收[6-7]、行為[8-10]等方面起著十分重要的作用。動物腸道是一個動態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，宿主本身和外界環(huán)境都會影響腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)。目前普遍認(rèn)為，宿主的飲食、生理狀態(tài)和宿主基因型是影響腸道菌群多樣性的重要原因，而宿主飲食對腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)影響最大[11-12]。腸道微生物與宿主動物相互作用、相互影響。

腸道微生物在脊椎動物中的研究主要集中在哺乳動物[11，13-17]，而非哺乳動物研究占比不到10%[18]，爬行動物的相關(guān)研究較少。爬行動物作為較古老的動物類群，具有復(fù)雜和多樣的生理生態(tài)和行為特征[19]，而作為外溫動物，受環(huán)境影響較大。爬行動物的這些特征使其腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)和多樣性更具獨特性和復(fù)雜性。

1 腸道微生物的研究手段

巴斯德(L.Pasteur)和柯赫(R.Koch)提出的純培養(yǎng)法技術(shù)開啟了動物腸道微生物的研究。腸道微生物的主要研究手段有：傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，該法是一種非常有效的分離目的菌種的方法，即通過篩選菌種和觀察形態(tài)來達(dá)到研究目的；此外還有分子生物學(xué)方法，包括熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)；變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)；末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)；實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，QRT-PCR)；生物芯片和正流行的高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing)等。16S rRNA基因已被證明是細(xì)菌鑒定的快速、準(zhǔn)確的工具[20-21]。細(xì)菌16S rRNA基因和高通量測序技術(shù)的結(jié)合使腸道微生物研究得以快速發(fā)展。目前，該方法已成為免培養(yǎng)研究微生物的重要手段。腸道微生物研究主要基于宿主的糞便樣本和泄殖腔樣本，均為無損傷取樣，其中Colston等[22]對利用泄殖腔拭子對泄殖腔采樣的方法進行了詳細(xì)介紹。

在早期，純培養(yǎng)技術(shù)是爬行動物腸道微生物研究的主要手段。施曼玲等[23]通過平板培養(yǎng)分析各類微生物(細(xì)菌、霉菌、放線菌、酵母菌)在北草蜥(Takydromusseptentrionalis)和中國石龍子(Plestiodonchinensis)的消化器官中的數(shù)量分布；李能樹等[24]通過平板培養(yǎng)探討烏龜(Mauremysreevesii)排泄物對魚病病原菌的抑制作用。而后，分子生物學(xué)方法開始運用到爬行動物腸道微生物的研究中。Rawski等[25]運用熒光原位雜交技術(shù)評估膳食益生菌對龜胃腸道微生態(tài)的影響；時云朵等[26]利用變性梯度凝膠電泳和實時熒光定量PCR分析蛇的腸道菌群結(jié)構(gòu)。現(xiàn)階段爬行動物腸道微生物最主要的研究手段是高通量測序，又稱為下一代測序(next generation sequencing，NGS)，其主流平臺有Roche 454和Illumina Miseq/Hiseq。Roche 454平臺的測序原理為焦磷酸測序(pyrosequencing)，該技術(shù)已被運用在蛇類[22，27]、蜥蜴類[28]、龜類[29]和鱷類[30]的腸道微生物研究中。Illumina Miseq/Hiseq平臺的測序原理為邊合成邊測序(sequencing by synthesis，SBS)，研究者們對蛇類[31-33]、蜥蜴類[34-42]、龜類[43-53]和鱷類[54-56]腸道微生物的研究應(yīng)用了此種方法。由于Illumina Miseq/Hiseq平臺的測序費用更低，且效果相差不大，因此得到了更多人的認(rèn)可。

2 爬行動物腸道微生物的分布特點

一般來說，脊椎動物的胃腸道主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)組成，這是一個相對保守的細(xì)菌組合，其他菌門的相對豐度則較低[57]。目前，研究發(fā)現(xiàn)蛇類[22，26-27，31-33，58]、蜥蜴類[28，36-38，41-42，59-61]和龜鱉類[43-47，50-53]動物腸道微生物的優(yōu)勢菌群也基本為這3個門。與哺乳動物和其他爬行動物不同，在鱷類[30，54-56]動物腸道微生物菌群中，梭桿菌門(Fusobacteria)的占比明顯提高，占有重要地位(表1)。

表1 爬行動物各類群腸道微生物的優(yōu)勢菌群

微生物在爬行動物腸道的不同區(qū)段具有差異性。黑眉錦蛇(Elaphetaeniura)的腸道微生物菌群豐度沿腸道頭部向尾部方向呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[26]。野生紅脖頸槽蛇(Rhabdophissubminiatus)胃腸道上段(食管和胃)與胃腸道下段(大腸和泄殖腔)的微生物多樣性具有顯著差異[31]。對澳大利亞咸水鱷，即灣鱷(Crocodylusporosus)的研究結(jié)果也表明沿腸道縱向的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)存在顯著差異[56]。美國短吻鱷(Alligatormississippiensis)同樣具有沿胃腸道縱向的異質(zhì)性微生物群，研究還揭示了其組成的差異與器官或組織以及飲食顯著相關(guān)[30]。但是，在野生虎斑頸槽蛇(Rhabdophistigrinus)的研究中，微生物的豐富度和多樣性在腸道不同區(qū)域(大腸、小腸和泄殖腔)并不存在顯著差異[32]。

3 爬行動物腸道微生物的影響因素

3.1 生殖狀態(tài)和方式

生殖狀態(tài)和方式與腸道微生物密切相關(guān)。利用16S rRNA基因測序技術(shù)，Trevelline等[62]發(fā)現(xiàn)受精卵孕育晚期的蜥蜴(Sceloporusundulatus)腸道細(xì)菌豐富度比未懷卵雌性蜥蜴低，且隨著孕育期的延長，個體間變異程度越高，但是腸道細(xì)菌群落的這些變化在產(chǎn)卵后是否會恢復(fù)還未知。在人類中，母體腸道細(xì)菌群落的變化至少在產(chǎn)后一個月內(nèi)持續(xù)存在[63]，蜥蜴是否與人類一致？有研究表明，生殖期的蜥蜴免疫功能下降[64-65]，這是否與腸道微生物豐富度降低有關(guān)？這些問題都值得進一步探究。研究發(fā)現(xiàn)，多個配偶的雌性蜥蜴的細(xì)菌多樣性比單個配偶的雌性高，這可能是多個配偶性傳播的細(xì)菌所導(dǎo)致，表明雌性交配策略影響泄殖腔細(xì)菌群落，這對雌性的健康存在潛在影響[66]。

一個多世紀(jì)以來，脊椎動物胚胎被認(rèn)為是在無菌環(huán)境中發(fā)育的，通過出生后與母體和外部環(huán)境的接觸獲得原始的腸道微生物群[67]，而Trevelline等[68]發(fā)現(xiàn)鳥卵和蜥蜴卵含有彼此不同的細(xì)菌群落，且同窩蜥蜴卵的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)彼此更相似，而非無關(guān)個體，表明野生卵生脊椎動物可能通過破殼前接種卵黃獲得了母體微生物群。

3.2 圈養(yǎng)、飲食和環(huán)境

腸道微生物常常受飲食和環(huán)境的影響，反過來，腸道微生物的組成也反映了宿主的飲食和生活環(huán)境[31]。而腸道和微生物群是高度動態(tài)的，可以進行靈活調(diào)整，以滿足生物體的需求[69]。

圈養(yǎng)和飲食對腸道微生物的影響一直受到重點關(guān)注。Kohl等[39]利用16S rRNA基因測序技術(shù)，探究飲食、環(huán)境和圈養(yǎng)等對蜥蜴腸道細(xì)菌群落組成的影響，研究發(fā)現(xiàn)性別和季節(jié)對細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)都沒有顯著影響，飲食類型(雜食性和草食性)和宿主物種對這2個指標(biāo)均有顯著影響；當(dāng)?shù)赝寥罉悠放c任何宿主物種腸道中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌類群沒有明顯的重疊，圈養(yǎng)則顯著改變了宿主物種的細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)。關(guān)于北草蜥的研究也表明圈養(yǎng)對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有顯著影響[42]。Jiang等[36]在比較野生與圈養(yǎng)鱷蜥(Shinisauruscrocodilurus)的糞便微生物時，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)不同食物的蜥蜴的腸道微生物群有顯著差異，飲食改變了腸道中細(xì)菌群落豐富度和相對豐度。另一項對鱷蜥的研究表明，與野生同類相比，圈養(yǎng)增加了鱷蜥腸道微生物群的群落豐富度，研究還發(fā)現(xiàn)年齡對腸道微生物無影響[59]。飲食不僅對腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生影響，還能改變動物腸道的結(jié)構(gòu)。Kohl等[35]以動植物混合食物和高植物含量食物分別喂養(yǎng)一種自然雜食性蜥蜴(Liolaemusruibali)，結(jié)果表明2組腸道形態(tài)和腸道微生物群結(jié)構(gòu)均有差異，富含植物的飲食使蜥蜴含有更多樣化微生物群落，說明生理和微生物并不嚴(yán)格限制草食動物從雜食祖先進化，生態(tài)環(huán)境對食草動物的進化可能比生理限制更重要。

環(huán)境和飲食相互作用于動物腸道微生物。不同的環(huán)境為動物提供不同的食物，所以動物處于不同環(huán)境中時其腸道微生物可能不同。綠海龜(Cheloniamydas)經(jīng)歷了從表層遠(yuǎn)洋分布和雜食性飲食向淺海分布和草食性飲食的明顯轉(zhuǎn)變。在遠(yuǎn)洋和淺海生境之間，亞成體綠海龜?shù)募?xì)菌群落存在顯著差異，這表明環(huán)境和飲食因素支持這些生境的綠海龜擁有不同的細(xì)菌群落[45]。對于取食藻類的海鬣蜥(Amblyrhynchuscristatus)和取食陸地植被的加拉帕戈斯陸鬣蜥(Conolophussubscristatus)，其飲食差異有助于腸道微生物群落的分化[28]。城市生活可以極大地影響蜥蜴?zhèn)€體的腸道微生物群，突出了腸道微生物可塑性在動物對人類改變的景觀中所起的作用[41]。熱帶海龜?shù)奈⑸锒鄻有愿哂趤啛釒У貐^(qū)[47]。Ahasan等[44]調(diào)查并比較了野生捕獲和擱淺的綠海龜糞便細(xì)菌群落，結(jié)果顯示野生捕獲綠海龜?shù)募?xì)菌多樣性和豐富度高于擱淺海龜，群落組成差異顯著，這可能是因為擱淺海龜通常只能吃到海草，它們虛弱的狀態(tài)使得條件致病菌在胃腸道內(nèi)繁殖和過度生長。通過對比入院前和康復(fù)后的海龜腸道微生物群落發(fā)現(xiàn)，不論海龜在入院前的微生物組成如何，所有康復(fù)后的綠海龜都表現(xiàn)出相似的細(xì)菌群落；入院前和康復(fù)后海龜腸道細(xì)菌群落的顯著差異表明康復(fù)過程中飲食、管理和環(huán)境變化對腸道微生物產(chǎn)生了影響[46]。同樣的，另一項研究也表明亞成體綠海龜?shù)募S便微生物群在康復(fù)過程中由于飲食變化而改變[51]。紅海龜(Carettacaretta)為食肉動物，主要以底棲軟體動物為食[70]。與系統(tǒng)發(fā)育相近但食草性海龜相比，紅海龜與食肉性海洋哺乳動物的腸道微生物群特征更相似，這是腸道微生物群對飲食和環(huán)境適應(yīng)功能的體現(xiàn)[48]。

海拔和溫度也成為影響蜥蜴腸道微生物的重要因素。在高海拔地區(qū)，蜥蜴的飲食多樣性和數(shù)量急劇下降，有限的食物資源迫使蜥蜴開發(fā)其他食物資源，使其腸道微生物群具有降解能力和解毒能力[60]。Zhang等[37]利用16S rRNA基因測序技術(shù)，研究了生活在不同海拔高度的3個蜥蜴種群的腸道菌群，結(jié)果顯示不同海拔的種群的腸道微生物組成存在顯著差異，而缺氧可能是引起青海沙蜥(Phrynocephalusvlangalii)腸道菌群沿海拔梯度變化的主要因素。已經(jīng)有研究表明，高原動物(青海沙蜥)的腸道質(zhì)量與海拔成正比[71]。Bestion等[38]采用半自然試驗研究了溫度對野生蜥蜴腸道微生物區(qū)系的影響，發(fā)現(xiàn)溫度升高將導(dǎo)致微生物多樣性降低，升高2～3 ℃會導(dǎo)致34%的種群微生物多樣性喪失，對宿主的生存可能產(chǎn)生較大的負(fù)面影響，這也反映了全球變暖可能會對爬行動物等變溫動物產(chǎn)生不利影響。此外，Bestion的研究是采用直接升溫的方式，若換成緩慢升溫的方式，給予動物適應(yīng)的過程，也許不會導(dǎo)致如此高的微生物多樣性喪失。

3.3 禁食行為

關(guān)于禁食，Kohl等[34]做了相關(guān)研究：使用16S rRNA基因測序記錄了5類脊椎動物的代表動物在4個時間點的結(jié)腸和盲腸微生物群的變化，發(fā)現(xiàn)禁食引起的微生物群在宿主物種和腸道區(qū)域之間的變化存在差異。魚類對禁食表現(xiàn)出最顯著的變化，而壁虎在禁食28 d內(nèi)可保持穩(wěn)定的群落。腸道微生物在禁食期間的穩(wěn)定性可能暗示宿主對微生物群落的高度控制。McCue等[72]對此進行了更進一步地研究，發(fā)現(xiàn)禁食導(dǎo)致的腸道末端微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化與腸道末端結(jié)構(gòu)變化并不匹配。研究表明，一些蜥蜴物種似乎適應(yīng)了饑餓[73-74]，依靠尾巴中儲存的脂質(zhì)，能夠在饑餓100 d后存活下來[75]。

爬行動物在禁食期間仍能保持穩(wěn)定的腸道微生物群，其內(nèi)在機理值得深入研究。大部分爬行動物還會進行冬眠，在冬眠期間具有禁食行為，若冬眠前后腸道微生物不發(fā)生變化，這將為爬行動物出眠后保持身體一致性并直接捕食提供保證。爬行動物腸道微生物與冬眠的關(guān)系還有許多值得探討之處，應(yīng)對其進行更深一步地研究。

3.4 健康狀態(tài)

在不同健康狀態(tài)下，爬行動物的腸道微生物具有差異性。此外，研究發(fā)現(xiàn)部分爬行動物的腸道微生物存在條件致病菌或潛在致病菌。在耐藥性分析時，發(fā)現(xiàn)爬行動物的糞便中含有耐藥性菌群和耐藥性基因。爬行動物腸道微生物不僅具有耐藥性，同時具有抗腫瘤性和殺菌活性的成分。

腸道微生物與動物健康息息相關(guān)。在同一養(yǎng)殖條件下，幾乎不患腸道疾病的王錦蛇(Elaphecarinata)糞便樣本中志賀氏菌(Escherichia-Shigella)的相對豐度高于其他2種錦蛇，這表明志賀氏菌含量可能與腸道健康相關(guān)[33]。湯文嬌等[32]在野生虎斑頸槽蛇腸道內(nèi)檢測到檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、明串珠菌屬(Trichococcus)和丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)等潛在的致病菌。Tang等[31]也在野生紅脖頸槽蛇腸道中發(fā)現(xiàn)大量潛在致病菌。還有研究表明人工飼養(yǎng)的蜥蜴富集了一些人類或其他動物的致病菌或條件致病菌[36]，這可能是人的近距離接觸所導(dǎo)致。Lin等[55]比較了健康和患有厭食癥的亞成體暹羅鱷(Crocodylussiamensis)的腸道微生物群落的組成和功能，發(fā)現(xiàn)厭食鱷魚腸道微生物多樣性明顯低于健康個體，鱷魚腸道細(xì)菌組成和功能的改變可能與厭食癥有關(guān)。為評估在臨床上應(yīng)用(包埋)噬菌體消除靶向腸道細(xì)菌作為廣譜抗生素(恩諾沙星)替代品的可行性，Ahasan等[49]分析了2種處理的海龜糞便樣品中腸道細(xì)菌群落，結(jié)果顯示噬菌體處理后的樣品細(xì)菌多樣性和組成無顯著差異，相比之下，抗生素處理的樣品在第15天后細(xì)菌多樣性顯著降低，表明噬菌體對海龜腸道細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)的影響很小，研究為噬菌體治療概念提供了有力證據(jù)。Pace等[76]通過細(xì)菌培養(yǎng)法和FLOTAC寄生蟲學(xué)技術(shù)，提供了地中海地區(qū)紅海龜腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和寄生蟲組成的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)：78.3%的糞便樣品都分離到了腸桿菌科，而復(fù)殖吸蟲(digenetic trematodes)是這些動物中最常見的寄生蟲；47.8%的海龜只有腸桿菌科寄生，而30.4%的海龜同時有腸桿菌科和寄生蟲寄生。

爬行動物腸道菌群具有耐藥性。Sala等[77]對從健康圈養(yǎng)蛇類群體微生物中分離出的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的患病率和抗生素耐藥性進行評價，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的患病率較高(59.9%)，其中35.5%為多重耐藥菌株。分析結(jié)果顯示養(yǎng)殖場規(guī)模、衛(wèi)生條件和蛇種類等與患病率相關(guān)。Nieto-Claudin等[78]通過對圣克魯斯島加拉帕戈斯象龜(Chelonoidisporteri)泄殖腔糞便進行耐藥性基因(antimicrobial resistance gene，ARG)分析，發(fā)現(xiàn)100%的象龜糞便中都含有ARG，35.7%的象龜微生物群具有多重抗性；與許多其他野生動物不同，陸龜通常與農(nóng)田重疊，增加了攝入和傳播耐藥性(antimicrobial resistance，AMR)的風(fēng)險。從歐洲池塘圈養(yǎng)的海龜泄殖腔中分離出來的微生物對用于治療動物和人類的主要抗菌類藥物也表現(xiàn)出廣泛的耐藥性，說明被圈養(yǎng)的歐洲池塘海龜是多抗細(xì)菌的載體[79]。

爬行動物腸道微生物不僅具有耐藥性，同時具有抗腫瘤性和殺菌活性的成分。Soopramanien等[61]研究了以有機廢物和動物尸體為食的圓鼻巨蜥(Varanussalvator)腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物的抗腫瘤特性，利用條件培養(yǎng)基和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)篩選和識別潛在的抗腫瘤分子，結(jié)果表明存在幾種具有抗腫瘤活性的分子。在另一項對圓鼻巨蜥的研究中，也發(fā)現(xiàn)其腸道微生物產(chǎn)生了具有顯著殺菌活性的分子[80]。圓鼻巨蜥的抗腫瘤性和殺菌活性可能與其長期的生活環(huán)境和食物有關(guān)。

4 其他相關(guān)研究

動物在接觸有害物質(zhì)后，其腸道微生物也會受到影響。綠海龜接觸草甘膦后，其腸道細(xì)菌生長減少或存活率降低，說明草甘膦可能對海龜?shù)南驼w健康產(chǎn)生不利影響[81]。這是首個評估草甘膦除草劑對爬行動物胃腸道菌群影響的研究，說明在沿海環(huán)境中使用草甘膦可能會通過皮膚接觸、海洋植物群落的變化或胃腸道微生物區(qū)系的改變對非目標(biāo)海洋物種產(chǎn)生有害影響。此外，腸道微生物組成的可預(yù)測變化可以為特定化學(xué)暴露提供一個易于分析的、無創(chuàng)的生物標(biāo)志物，為軍事設(shè)施的風(fēng)險評估提供更有力的科學(xué)支持[40]，腸道微生物還可作為判斷圈養(yǎng)動物放歸的參考條件[82]。馮定龍[54]的研究發(fā)現(xiàn)揚子鱷(Alligatorsinensis)捕食期與非捕食期胃內(nèi)菌群差異性顯著，非捕食期胃內(nèi)微生物具有更高的豐富度和均勻度；剛孵化出的幼鱷其胃內(nèi)已存在大量細(xì)菌菌群，且具有很高的物種豐富度和均勻度。另有研究[25]表明膳食益生菌對龜?shù)纳L性能、殼礦化、十二指腸組織形態(tài)學(xué)和微生物區(qū)系有積極作用，說明益生菌在龜營養(yǎng)中是有用的。Scheelings等[53]嘗試探究微生物組成在確定平背龜(Natatordepressus)的一些血液參數(shù)方面的作用，發(fā)現(xiàn)腸道微生物組成與血液分析物沒有任何相關(guān)性。

5 結(jié)語與展望

研究表明，爬行動物腸道微生物：現(xiàn)階段的研究手段以高通量測序為主；在腸道的不同區(qū)段具有差異性；影響因素有寄主生殖狀態(tài)、圈養(yǎng)、飲食、環(huán)境和行為等；具有耐藥性和抗腫瘤性等特性；當(dāng)動物在接觸有害物質(zhì)后，其腸道微生物也會受到影響?，F(xiàn)階段對爬行動物腸道微生物的研究主要還是以菌群組成及多樣性分析為主，但近年來已經(jīng)開始深入到了菌群功能分析，且還涉及了很多其他的方面，然而對于腸道微生物與宿主間相互影響的作用機制還不明確。全球氣溫升高、生境喪失和破碎化、環(huán)境污染等人類干擾活動，導(dǎo)致爬行動物生存環(huán)境發(fā)生變化，可能使爬行動物的腸道微生物發(fā)生相應(yīng)變化，從而使爬行動物種群受到不利影響。所以，未來應(yīng)充分利用宏基因組、宏蛋白組和宏代謝組的高通量測序和分析技術(shù)，深度發(fā)掘和揭示腸道微生物和宿主之間的關(guān)系，加強人類干擾導(dǎo)致的爬行動物腸道微生物發(fā)生變化的情況和機理方面的研究，以便有針對性地采取措施保護相應(yīng)物種。