宋馨，王慧，袁世豪，黃佳偉，易文濤，艾連中

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

乳酸乳球菌(Lactoccuslactis)是一種公認的益生菌，被應用于發(fā)酵乳制品中的歷史已達數(shù)千年。在食品工業(yè)中，乳酸乳球菌作為復合發(fā)酵劑的重要組成部分，主要應用于葡萄酒、乳酪及腌制食品中[1-3]。另一方面，乳酸乳球菌作為乳酸菌的代表菌株，其基因組規(guī)模相對較小[4]，較乳桿菌容易操作，在基因工程及代謝方面也已經(jīng)作為理想的模型菌株、微生物細胞工廠[5]。由于乳酸乳球菌不含內(nèi)毒素，現(xiàn)已成為枯草芽孢桿菌及大腸桿菌等更安全的替代菌種[6]，并逐漸成為實驗室用來異源蛋白表達和各種類型生理研究的主力軍[7]。近年來，益生菌被開發(fā)用作口服疫苗載體，乳酸乳球菌具有良好的免疫調(diào)節(jié)特性、公認的安全性、在腸道內(nèi)極少定植并且是異源蛋白生產(chǎn)的有效細胞工廠[8-9]，因此被選作體內(nèi)運送載體，用以輸送治療劑(如細胞因子)。因此，研究乳酸乳球菌在體內(nèi)的運送情況具有重要意義。但目前對乳酸菌的運送研究大多通過體外模擬實驗和細胞實驗，無法真實反映體內(nèi)情況[10-13]。要研究乳酸乳球菌在體內(nèi)的運送，需要對其進行標記。增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)具有穩(wěn)定遺傳，靈敏度高，對細胞無毒害等特點，并能利用不同啟動子調(diào)節(jié)其表達量，更適合用作乳酸乳球菌體內(nèi)研究的報告基因[14]。大多數(shù)研究通常采用質(zhì)粒對其進行宿主中的過表達[15-16]，但是這種方法穩(wěn)定性低，且必須引入抗性篩選標記，而將eGFP基因整合到基因組中，可成功避免此缺點。

乳酸乳球菌中已開發(fā)多種表達蛋白的工具，但大多應用起來耗時耗力。隨著生物技術(shù)的不斷完善，第三代人工核酸酶(CRISPR-Cas9)被深入研究，人們在不同生物體內(nèi)陸續(xù)構(gòu)建成功基于CRISPR-Cas的高效基因編輯工具，使研究人員能夠?qū)μ囟ǖ幕蚧蚧蚪M上的特定位點進行精確的靶向修飾，該工具目前已在乳酸菌中得到廣泛應用[17]。本實驗室已成功構(gòu)建了適用于乳酸乳球菌，基于CRISPR-Cas9的單質(zhì)?；蚓庉嫻ぞ撸軌?qū)θ樗崛榍蚓M行無痕基因編輯[18]。

本研究基于實驗室已有的乳酸乳球菌基因編輯質(zhì)粒pLL25，替換目標基因的sgRNA及同源臂，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYSH，利用CRISPR-Cas9編輯技術(shù)，將eGFP基因插入L.lactisNZ9000基因組中，使L.lactis被綠色熒光標記，為L.lactis在體內(nèi)運送或其他功能的深入研究提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

表1和表2列出本研究所用菌株、質(zhì)粒及引物。Snapgene 4.1.9設計引物，華大基因(上海)股份有限公司合成。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.1.2 菌株及培養(yǎng)條件

大腸桿菌DH5α為克隆宿主，培養(yǎng)基為LB(luria-bertani)，所有含有基因編輯質(zhì)粒的大腸桿菌生長于LB-Kan(卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg/mL)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為30 ℃。GM17培養(yǎng)基用于乳酸乳球菌的培養(yǎng)，配方為(g/L)：胰蛋白胨5、大豆蛋白胨5、牛肉膏5、酵母浸出粉2.5、β-磷酸甘油二鈉19、MgSO4·7H2O 0.25、葡萄糖5、瓊脂粉(Agar)15(液體培養(yǎng)時不添加)，必要時，添加紅霉素作為篩選標記，工作質(zhì)量濃度為10 μg/mL。乳酸乳球菌復蘇培養(yǎng)基：GM17，CaCl22 mmol/L,MgCl220 mmol/L。

乳酸乳球菌感受態(tài)洗滌緩沖液Ⅰ：體積分數(shù)為10%的甘油、0.5 mol/L 蔗糖；洗滌緩沖液Ⅱ：體積分數(shù)為10%的甘油、0.5 mol/L蔗糖和0.05 mol/L EDTA；洗滌緩沖液Ⅲ：100 mmol/L 乙酸鋰二水、10 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、0.6 mol/L 蔗糖、1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)[19]。

1.1.3 酶及試劑盒

PremixTaqTM酶、DNA限制性內(nèi)切酶，大連寶生物公司；KOD-plus-neo DNA聚合酶或KOD FX聚合酶，用于PCR擴增及菌落PCR分析，東洋紡生物科技有限公司；無縫克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)，用于DNA組裝及質(zhì)?？寺?，割膠回收試劑盒(AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit)、質(zhì)粒小量提取試劑盒(AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit)，用于DNA 操作，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1E.coliTop10感受態(tài)細胞制備

-80 ℃凍存的E.coliTop10劃線活化，單菌落接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜。種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB液體中(置于250 mL錐形瓶中)，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=0.3～0.5，冰上靜置10 min。離心收集菌體，用預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液洗滌細胞2次。預冷的含有0.1 mol/L CaCl2的15%甘油溶液重懸細胞。分裝，-80 ℃凍藏備用。以上所有離心條件均為4 ℃，4 500 r/min，10 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒pYSH構(gòu)建

以質(zhì)粒pLL25為模板，HA1-F、HA1-R、HA2-gRNA-F、HA2-gRNA-R為引物，分別PCR擴增獲得上下游同源臂HA-1、HA-2；以pIB184-eGFP為模板，P23E-F、P23E-R為引物，擴增獲得插入片段P23-eGFP。PCR反應條件參考說明書。割膠回收上下游同源臂HA-1、HA-2及插入片段P23-eGFP，按摩爾數(shù)比為1∶1∶1混合后為模板，以HA1-F/HA2-gRNA-R為引物，overlap 獲得片段HA-1+P23+eGFP+HA-2，割膠回收。ApaI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pLL25骨架，割膠回收獲得線性化載體。將線性化載體骨架與目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2經(jīng)ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit無縫克隆連接，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pYSH(構(gòu)建過程如圖1所示)。PCR驗證引物為TY-F/R。

1.2.3L.lactisNZ9000感受態(tài)制備方法

劃線活化L.lactisNZ9000，挑取單菌落，接種于GM17液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)活化2代。以8%的接種量轉(zhuǎn)接至含有0.5 mol/L蔗糖和8 g/L甘氨酸的GM17液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)至吸光值OD600≈0.2，離心收集菌體，棄去上清液，溶液Ⅲ重懸細胞，室溫靜置30 min，離心收集菌體，棄去上清液，溶液Ⅰ、Ⅱ分別洗滌細胞，最后重懸于溶液I中。每100 μL感受態(tài)細胞分裝于預冷的離心管中，-80 ℃凍藏備用。以上所有離心條件為4 ℃，6 000 r/min，15 min[19]。

圖1 pYSH質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid pYSH construction

1.2.4L.lactisNZ9000熒光標記

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pYSH電轉(zhuǎn)至L.lactisNZ9000感受態(tài)細胞中，方法如下：取出-80 ℃冰箱凍存的L.lactisNZ9000感受態(tài)細胞，冰上解凍；向感受態(tài)細胞中加入0.1 μg pYSH質(zhì)粒并吹打混勻，冰上靜置5 min；預冷2 mm電轉(zhuǎn)杯，將混合有質(zhì)粒的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至其中，輕輕敲打，使其落于電轉(zhuǎn)杯底部，電擊，隨后迅速加入900 μL 30 ℃溫育的復蘇培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)至離心管中，30 ℃ 復蘇培養(yǎng)2 h；將復蘇液涂布于GM17-Em固體平板，30 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h，挑取轉(zhuǎn)化子，菌落PCR驗證，驗證引物為YZ-F/R，L.lactisNZ9000野生型為對照。對PCR產(chǎn)物送測。將測序正確的菌株命名為L.lactisNZ9000Δldh:eGFP。

1.2.5L.lactisNZ9000Δldh:eGFP熒光強度的測定

將野生型L.lactisNZ9000和突變型L.lactisNZ9000Δldh:eGFP菌株劃線活化，30 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h，獲得單菌落，挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接至GM17無抗及含抗的液體培養(yǎng)基。30 ℃靜置培養(yǎng)，分別在對數(shù)期前期、對數(shù)后期、穩(wěn)定期收集1.5 mL菌液，條件為12 000 r/min、離心1 min；20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)溶液洗滌菌體2次，重懸，混勻后加入96孔板(每個樣品取100 μL)。在激發(fā)波長480、發(fā)射波長525下，用酶標儀測量其eGFP的表達強度及OD600。每個樣品3個平行[20]。使用GraphPad Prism 8.4.0繪圖，并對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，比較不同時期突變型菌株與野生型菌株熒光強度的差異，認為P<0.05有統(tǒng)計學差異(***P<0.001，****P<0.000 1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pYSH構(gòu)建

目的片段HA-1、P23+eGFP、HA-2大小分別為1 044、955、1 150 bp，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示，大小與目的條帶一致，說明擴增成功。

M:DL 5 000 DNA markera- PCR擴增HA-1;b-PCR擴增P23+eGFP;c-PCR擴增HA-2圖2 PCR擴增HA-1、P23+eGFP、HA-2Fig.2 PCR amplified the fragment HA-1、P23+eGFP and HA-2

目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2大小為3 016 bp，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示，大小與目的條帶一致，說明overlap擴增成功。

a-PCR擴增HA-1+P23+eGFP+HA-2(M-DL 5 000 DNA marker);b-Apa I/Xba I酶切pLL25(M-DL 15 000 DNA marker)圖3 PCR擴增HA-1+P23+eGFP+HA-2及雙酶切載體pLL25Fig.3 PCR amplified the fragment HA-1+P23+eGFP+HA-2 and double enzyme digested the vector pLL25

ApaI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pLL25，可獲得1 547、564、12 136 bp的線性化DNA片段，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3，所得條帶與理論條帶一致，說明酶切正確，可用于后續(xù)實驗?；厥沾笮?2 136 bp的條帶作為載體片段，再與目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2連接，利用E.coliTop 10感受態(tài)細胞對連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化克隆中，卡那霉素為篩選標記，30 ℃靜置培養(yǎng)至長出單菌落，對其進行菌落PCR驗證，驗證引物為TY-F/R。獲得陽性轉(zhuǎn)化子，并對其進行測序鑒定。將測序結(jié)果與目的序列進行比較，序列完全一致，說明質(zhì)粒pYSH構(gòu)建成功，可用于乳酸乳球菌基因組的編輯。

2.2 L.lactis NZ9000熒光標記

將構(gòu)建成功的基因編輯質(zhì)粒pYSH電轉(zhuǎn)入L.lactisNZ9000感受態(tài)細胞中，涂布到帶有紅霉素的篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)24～36 h，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，驗證結(jié)果如圖4所示。

M-DL 5 000 DNA marker;1～12-轉(zhuǎn)化子PCR驗證;13～14-pLL25;15～16-L.lactis NZ9000圖4 PCR驗證轉(zhuǎn)化子Fig.4 PCR verified transformants

將驗證有正確條帶的陽性轉(zhuǎn)化子挑取到GM17含紅霉素液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)3代，取菌液為模板，用引物Cldh-HA-YZ-F/R進行PCR驗證，PCR產(chǎn)物送測。測序結(jié)果顯示eGFP成功插入L.lactisNZ9000基因組，獲得L.lactisNZ9000Δldh:eGFP突變株。

2.3 L.lactis NZ9000Δldh:eGFP熒光強度的測定

以野生型L.lactisNZ9000為對照，測量不同時期突變菌株L.lactisNZ9000Δldh:eGFP的熒光強度(圖5)。結(jié)果表明，不同生長時期，突變型菌株的熒光強度與野生型均有極顯著性差異。

圖5 不同生長時期熒光表達情況Fig.5 Fluorescence expression in different growth stages注：***表示P<0.001,****表示P<0.000 1

3 結(jié)論與討論

食品級乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是開發(fā)口服載體的良好候選菌，也是黏膜輸送策略中減毒病原體的有吸引力的替代品。其中，乳酸乳球菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，并且在腸道內(nèi)極少定植，是一種良好的疫苗及治療劑等運送載體，具有極大的應用前景。目前，越來越多的研究聚焦于乳酸乳球菌的體內(nèi)運送情況，但大部分研究都是通過體外模擬或細胞實驗進行的，與體內(nèi)真實運送情況存在一定差異。對乳酸乳球菌進行標記，可以幫助研究其在體內(nèi)的實際運送情況。在乳酸菌中，近幾年常用的標記方法為熒光素類探針標記法，該方法易被樣品背景干擾，并且熒光素極易在強光下分解，對pH敏感[21]，因此亟需一種更加穩(wěn)定高效的基因組標記方法。乳酸乳球菌中應用最多的基因插入法是基于質(zhì)粒的同源重組法，但該方法耗時久、效率低，且重組效率依賴于宿主細胞的電轉(zhuǎn)效率和自身重組酶。本研究利用已構(gòu)建的CRISPR/Cas9單質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)將eGFP基因插入L.lactisNZ9000基因組中，利用綠色熒光蛋白標記L.lactisNZ9000，成功獲得標記突變株。該突變株性能穩(wěn)定，無需添加抗性篩選標記，實時定量PCR測定熒光強度，結(jié)果表明該突變株中的綠色熒光蛋白在宿主不同生長階段均能穩(wěn)定表達熒光，且能隨宿主的繁殖穩(wěn)定遺傳，相比傳統(tǒng)方法節(jié)約前處理時間，省時省力，為進一步深入研究乳酸乳球菌在體內(nèi)的運送情況提供良好的載體。