楊晴晴，段 暢，王皓梵，蔣冬媛, 田慶豐，封全靈

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在各大腫瘤中排名第四[1]。在大多數(shù)情況下，人乳頭狀瘤病毒(HPV)的高危亞型是該病的病因，這種病基本上是可以預(yù)防的。大約90%的宮頸癌發(fā)生在低收入和中等收入國(guó)家，這些國(guó)家缺乏有組織的篩查和HPV疫苗接種計(jì)劃[2]。近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病朝著年輕化方向發(fā)展，除了高危的HPV感染因素外，遺傳因素和免疫因素也在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。Wnt家族是進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族，Wnt信號(hào)參與了胚胎發(fā)育和維持正常成人體內(nèi)平衡的許多基本過(guò)程[3]。這種信號(hào)通路的功能障礙可能會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)出生缺陷、神經(jīng)退行性變、骨骼缺陷以及各種癌癥，包括胃腸道腫瘤、乳腺癌、上皮性惡性腫瘤等的發(fā)生[4-7]。Dickkopf-1(DKK1)是一種分泌型Wnt拮抗劑，在人體組織中參與組織的形成、再生和修復(fù)過(guò)程[8]。分泌型DKK1被認(rèn)為通過(guò)與LRP6共受體結(jié)合來(lái)抑制典型Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，阻止激活信號(hào)復(fù)合物的形成，從而導(dǎo)致胞漿β-catenin降解和核β-catenin依賴(lài)基因轉(zhuǎn)錄的降低[9]。DKK1表達(dá)的失調(diào)與多種癌癥的轉(zhuǎn)移有關(guān)，DKK1表達(dá)水平升高與多發(fā)性骨髓瘤，前列腺癌和肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后相關(guān)[10]。然而，在腎細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌中，DKK1表達(dá)水平下調(diào)，充當(dāng)抑癌基因[11-12]。目前，有關(guān)DKK1與宮頸癌的關(guān)系研究較少。該研究采用RT-PCR技術(shù)和免疫組化方法來(lái)探討DKK1在宮頸癌中的表達(dá)及其在宮頸癌中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2018年1月—2020年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)為宮頸癌的標(biāo)本30例，所有患者均收集宮頸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁織，對(duì)應(yīng)癌旁組織距離癌組織均1 cm以上?；颊咂骄挲g26～68(45.0±5.5)歲，以上患者術(shù)前均未接受放化療，標(biāo)本收集后存放在-80 ℃冰箱中保存，所有患者在獲得樣本前均獲得知情同意。然后，在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理中心收集了2015年9月—2018年9月手術(shù)治療后的60例石蠟包埋的宮頸癌樣本，以30例因子宮良性病變行子宮全切的患者標(biāo)本作為對(duì)照。根據(jù)WHO分級(jí)對(duì)腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型和等級(jí)進(jìn)行分類(lèi)，根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)確定腫瘤分期。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從臨床組織中提取總RNA，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用RT-for-PCR試劑盒(日本Takara公司)將1 μg RNA轉(zhuǎn)化為cDNA(反應(yīng)系統(tǒng)10 μl)。將2 μl cDNA與SYBR Green混合后，使用CFX96TMReal-Time系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)qPCR(RT-qPCR)(反應(yīng)系統(tǒng)20 μl)：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、30 s,40個(gè)循環(huán)。GAPDH的上游引物：5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG-3′，下游引物：5′-CTGTTGTCGGAGTTCTAGTAG-3′；DKK1的上游引物：5′-TATCACACCAAAGGACAAG-3′,下游引物：5′-TGATGGTGATCTTTCTGTAT-3′；GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照，使用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2免疫組化法 通過(guò)免疫組化分析檢測(cè)60例宮頸癌組織，30例正常組織。將5 μm厚的石蠟包埋切片在60 ℃下烘烤1 h，用二甲苯脫石蠟，再水化，用EDTA緩沖液高壓處理進(jìn)行抗原修復(fù)，再用PBS沖洗3遍，非特異性抗體用0.5%小牛血清白蛋白來(lái)封閉15 min，加一定稀釋度的一抗 50 μl(1 ∶500)，陰性對(duì)照用PBS，用已驗(yàn)證的陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，放4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。生物素標(biāo)記羊抗兔IgG 50 μl滴加在每張切片上，每張切片上滴加50 μl鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶溶液，Tris緩沖液震洗3次，5 min/次。在顯微鏡下，用0.04% DAB-H2O2顯色5～20 min。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，用乙醇分化 ，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片觀察。 請(qǐng)2名病理科醫(yī)師，采用雙盲法觀察免疫組化染色后的組織并評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)胞漿染色情況和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)判定蛋白的表達(dá)水平。先按染色強(qiáng)度打分：無(wú)色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；再按陽(yáng)性細(xì)胞百分比打分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)≥2為陽(yáng)性，染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)<2分為陰性。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)30例冰凍宮頸癌組織中DKK1的表達(dá)量qRT-PCR 結(jié)果顯示，CC組中DKK1 mRNA的表達(dá)量小于癌旁對(duì)照組中DKK1 mRNA的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.019,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 DKK1 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量與癌旁組織比較：*P<0.05

2.2 CC組和對(duì)照組臨床病理特征60例CC組患者和30例對(duì)照組臨床病理特征見(jiàn)表1，根據(jù)臨床病例報(bào)告顯示，CC組和對(duì)照組在年齡、初潮年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)和癌癥家族史等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，與對(duì)照組相比，DKK1在CC組的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032),見(jiàn)圖2、表2。

表1 CC組和對(duì)照組的部分臨床特征

圖2 DKK1蛋白在CC組織和正常宮頸組織中的表達(dá)A：DKK1在CC組織中低表達(dá) ×100；B：DKK1在CC組織中低表達(dá) ×400；C：DKK1在正常宮頸組織中高表達(dá) ×100；D：DKK1在正常宮頸組織中高表達(dá) ×400

表2 DKK1在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)(n)

2.3 DKK1表達(dá)與宮頸癌組織的臨床病理特征的關(guān)系χ2檢驗(yàn)顯示(表3)，DKK1蛋白表達(dá)與年齡、腫瘤大小、HPV感染和組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)(P>0.05)。在宮頸癌早期中的表達(dá)高于晚期(P=0.031),無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.017)，浸潤(rùn)深度淺肌層組高于深肌層組(P=0.009)，高分化組的表達(dá)高于低分化組(P=0.022)。此外，斯皮爾曼相關(guān)分析顯示，DKK1表達(dá)與與患者年齡(ρ=-0.129，P=0.324)、腫瘤大小(ρ=-0.158，P=0.228)、HPV有無(wú)感染(ρ=0.184，P=0.159)以及組織病理類(lèi)型(ρ=-0.094，P=0.473)無(wú)明顯相關(guān)。DKK1低表達(dá)與臨床病理分期(ρ=-0.279，P=0.031)、組織分化程度(ρ=-0.295，P=0.022)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(ρ=-0.307，P=0.017)及浸潤(rùn)深度(ρ=-0.339，P=0.008)密切相關(guān)，相關(guān)性為負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果表明DKK1低表達(dá)可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

表3 DKK1表達(dá)與宮頸癌組織的臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

在女性癌癥患者中，宮頸癌排名第四，盡管宮頸癌的發(fā)病率和病死率呈下降趨勢(shì)，但它仍然是威脅女性生命健康的重要“殺手”。目前，宮頸癌的主要治療方法是手術(shù)、化療、放療和聯(lián)合治療等，但對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移患者治療效果并不理想。宮頸癌的發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的癌變過(guò)程，涉及癌基因、抑癌基因的失活及基因調(diào)控的失衡等[13]。最近研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路在腫瘤的轉(zhuǎn)移和免疫監(jiān)視中具有重要意義，Wnt通路通常分為β-連環(huán)蛋白依賴(lài)(典型)和獨(dú)立(非典型)信號(hào)通路。DKK1是DKK蛋白家族的一部分，屬于分泌型Wnt糖蛋白，這種分泌蛋白具有高度保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，它能抑制Wnt/ β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Wnt配體通過(guò)與Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5/6(LRP5/6)結(jié)合激活Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致β-catenin的核移位，而DKK1與LRP5/6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止Wnt-Frizzled-LRP5/6復(fù)合物的形成，從而阻斷Wnt信號(hào)通路，引起蛋白酶體β-catenin降解、誘導(dǎo)凋亡和阻止細(xì)胞增殖[14]。

DKK1的功能在不同類(lèi)型的癌癥中有所不同。一些研究者認(rèn)為DKK1是一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑癌基因，如DKK1在腎細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌中下調(diào)，在肺癌患者血清中也顯著降低，治療后能迅速恢復(fù)正常水平[11]。然而，一些研究認(rèn)為DKK1的高表達(dá)是獨(dú)立有害的因子，如DKK1在肝細(xì)胞癌和骨髓瘤中作為癌基因過(guò)度表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞中還參與骨轉(zhuǎn)移[15]。在眾多癌癥研究的基礎(chǔ)上，該研究采用RT-PCR技術(shù)和免疫組化法檢測(cè)DKK1在宮頸癌組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄水平上，DKK1在宮頸癌組織中的mRNA表達(dá)量低于癌旁正常組織，在蛋白質(zhì)水平上，免疫組化顯示DKK1在宮頸癌組織中低表達(dá)，由此分析在正常宮頸發(fā)展為宮頸癌的過(guò)程中，DKK1下調(diào)可能促進(jìn)其發(fā)生，具有腫瘤啟動(dòng)子的特性。另外，DKK1作為Wnt信號(hào)通路中的核心成員，它的表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)分化和向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這一過(guò)程常涉及癌細(xì)胞失去上皮特征而獲得間質(zhì)特性，血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及淋巴擴(kuò)散均受Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控[16]。該研究對(duì)免疫組化的結(jié)果進(jìn)行臨床分析顯示宮頸癌中DKK1的表達(dá)水平在臨床病理分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵入深肌層和低分化狀態(tài)中減少，由此可見(jiàn)DKK1下調(diào)可能與宮頸癌的惡性發(fā)展相關(guān)，是促進(jìn)宮頸癌進(jìn)一步惡化的重要因子。

從HPV感染到宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)相對(duì)緩慢的過(guò)程，多數(shù)HPV感染是“一過(guò)性”的，并不引致宮頸病變，高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。高危型HPV感染中，約70%與HPV16型和HPV18型相關(guān)，高危型HPV產(chǎn)物E6蛋白結(jié)合抑癌基因p53，通過(guò)刺激泛素化介導(dǎo)p53蛋白降解。同樣，高危型HPV產(chǎn)物E7蛋白抑制pRb抑癌蛋白活性，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖[17]。根據(jù)免疫組化結(jié)果，該研究采用斯皮爾曼相關(guān)分析DKK1表達(dá)與宮頸癌組織的臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果并未顯示DKK1的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、HPV有無(wú)感染以及組織病理類(lèi)型明顯相關(guān)。

綜上所述，在宮頸癌中，DKK1是抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的抑癌基因，可能作為抑制性配體拮抗Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。DKK1在宮頸癌組織中表達(dá)的臨床意義需要大樣本數(shù)據(jù)，本次免疫組化的樣本量不足夠，存在局限性。另外，該實(shí)驗(yàn)未涉及DKK1在宮頸癌中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究，還需進(jìn)一步深入探討。