董慶泰，林振宇，李中虎，張智勇，馬丹丹，蔡 遜

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。在2018年公布的全球36種惡性腫瘤數(shù)據(jù)中，肝癌患者占惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)4.7%，位居第7位；肝癌患者占死亡病例數(shù)8.2%，位居第2位[1]。原發(fā)性肝癌中85%～90%病理分型為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[2]。目前HCC最有效的治療手段是早期手術(shù)，且早期診療患者的5年生存率超過(guò)70%，遠(yuǎn)高于晚期(低于16%)[3]。但HCC起病隱匿，大多數(shù)患者首次診斷即為中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[4]。因此，尋找對(duì)HCC敏感且特異性高的新型生物標(biāo)志物和新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)有重大意義。

Progestin and adipoQ receptor family member 4(PAQR4)屬于PAQR基因組家族(PAQR1-PAQR11)中的一員，定位于人類染色體16p13.3，包含3個(gè)外顯子[5]。已有研究表明PAQR4參與人體惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7-8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]，且PAQR4都表現(xiàn)出癌基因的特性。但目前PAQR4在HCC中的表達(dá)及其對(duì)HepG2細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究報(bào)道甚少。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析收集TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)中PAQR4在HCC中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言整理兩組數(shù)據(jù)，并分析PAQR4在HCC中的表達(dá)差異及臨床預(yù)后。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待貼壁后，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)載體Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-PAQR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，將空載體pcDNA3.1-vector轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為其對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR(Real-time PCR)測(cè)定法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種于96孔板，24 h后轉(zhuǎn)染，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。設(shè)置復(fù)孔4個(gè)/組，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入CCK-8試劑，每孔10 μl，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。最后進(jìn)行檢測(cè)(酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm)，記錄吸光度值。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)胰酶消化對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108個(gè)/L，并接種到含有無(wú)血清培養(yǎng)基的Transwell小室上層中，加入細(xì)胞懸液100 μl/孔。下室內(nèi)加入600 μl新鮮培養(yǎng)基。置入配養(yǎng)箱中培育24 h后，在室溫下每孔加入4%多聚甲醛1 ml固定10 min，甲醇對(duì)細(xì)胞通透處理20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，自然風(fēng)干后在顯微鏡下以200倍放大觀察染色細(xì)胞。設(shè)置復(fù)孔3個(gè)/組。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，分別用胰酶消化后鋪于6孔板中，接種細(xì)胞約5×105個(gè)/孔。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿貼壁，用10 μl消毒槍頭垂直劃痕，PBS沖洗3遍，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、24、48 h拍攝顯微鏡放大200倍下的圖片。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡用胰酶消化對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)整密度為1.0×105個(gè)/ml，接種于96孔板中培養(yǎng)48 h后，PBS清洗2次，低溫下加入Binding Buffer重懸細(xì)胞。室溫避光條件下取100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞加入5 μl的 AnnexinV-FITC反應(yīng)10 min，再加入5 μl的碘化丙啶(propidium iodide, PI)反應(yīng)10 min。最后加入400 μl Binding Buffer緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。設(shè)置復(fù)孔3個(gè)/組。

2 結(jié)果

2.1 PAQR4 mRNA在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)差異收集整理出TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于HCC共424個(gè)樣本，包括50個(gè)癌旁組織和374個(gè)癌組織，PAQR4 mRNA在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1A。50例HCC患者的配對(duì)癌組織和癌旁組織中，癌組織中PAQR4 mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1B。

圖1 采用Wilcoxon signed-rank檢驗(yàn)分析PAQR4在非配對(duì)和配對(duì)的癌組織和癌旁組織樣本中的表達(dá)水平A：非配對(duì)；B：配對(duì)；與癌旁組織比較：***P<0.001

2.2 PAQR4與HCC患者臨床預(yù)后的關(guān)系在全部374個(gè)癌組織樣本中，PAQR4 mRNA高表達(dá)組總體生存率低于低表達(dá)組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，見圖2。HCC患者Cox回歸分析結(jié)果如表1所示，單因素Cox分析結(jié)果顯示PAQR4 mRNA表達(dá)水平(HR=1.104, 95%CI:1.051～1.160,P<0.001)、T分期(HR=1.816, 95%CI:1.442～2.287,P<0.001)、M分期(HR=3.924，95%CI:1.230～12.519,P=0.021)、病理分期(HR=1.879, 95%CI:1.466～2.408,P<0.001)對(duì)HCC患者的預(yù)后存在顯著影響。多因素Cox分析結(jié)果顯示PAQR4 mRNA表達(dá)水平(HR=1.396, 95%CI:1.081～1.804,P=0.011)是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖2 PAQR4 mRNA表達(dá)水平對(duì)HCC患者的總體生存的影響

表1 Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析HCC患者PAQR4 mRNA表達(dá)水平及其他臨床病理特征與總生存率的相關(guān)性

2.3 過(guò)表達(dá)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，24、48、72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組的OD值較對(duì)照組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.05、10.47、3.82,P<0.05 )。見圖3。上述結(jié)果表明PAQR4促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖。

圖3 CCK-8檢測(cè)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 過(guò)表達(dá)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.03,P<0.01)。見圖4。結(jié)果表明PAQR4增加了HepG2細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 Transwell檢測(cè)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響 ×200與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.5 過(guò)表達(dá)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24、48 h后實(shí)驗(yàn)組愈合率較對(duì)照組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.13、4.40,P<0.05)。見圖5。以上表明PAQR4增加了HepG2細(xì)胞的遷移能力。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響 ×200與對(duì)照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.6 過(guò)表達(dá)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，48 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=41.44,P<0.001)。見圖6。此結(jié)果表明PAQR4抑制了HepG2細(xì)胞凋亡。

圖6 PI & Annexin V檢測(cè)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較：***P<0.001

3 討論

PAQR家族(PAQR1-PAQR11)基因最先由Tang et al[5]于2005年定義并命名，該家族所有成員所編碼的蛋白都包含7個(gè)跨膜域，但其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)又不同于傳統(tǒng)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白。目前，國(guó)內(nèi)外已有研究表明人體內(nèi)PAQR家族基因的異常表達(dá)與體內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如胃癌[11]、結(jié)腸癌[12]、肝癌[13]等。PAQR4作為PAQR家族基因中的一員在腫瘤的發(fā)生中同樣起著關(guān)鍵作用，有報(bào)道[14]表明PAQR4和SKP2通過(guò)相互之間的拮抗作用調(diào)節(jié)老鼠體內(nèi)CDK4蛋白的水平進(jìn)而間接參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這為后續(xù)PAQR4在人體內(nèi)腫瘤的相關(guān)研究提供了線索，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于PAQR4在HCC中的表達(dá)及意義的研究甚少。

Zhang et al[6]研究表明PAQR4 mRNA的表達(dá)水平在乳腺癌組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)存在差異，且PAQR4 mRNA的高表達(dá)與乳腺癌患者更差的預(yù)后相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織中PAQR4呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，且PAQR4高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者相對(duì)于PAQR4低表達(dá)的患者的總體生存率更低[8]。PAQR4 mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)量相對(duì)于其配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)量高，且PAQR4 mRNA的高表達(dá)與前列腺癌的大小、病理分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]。PAQR4 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織[10]。這些研究均提示PAQR4在人體惡性腫瘤的發(fā)生中表現(xiàn)出癌基因的特性。在該研究中，利用從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的高通量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)PAQR4在HCC中的表達(dá)和預(yù)后進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；結(jié)果顯示PAQR4 mRNA在HCC組織中高表達(dá)，且PAQR4 mRNA高表達(dá)的HCC患者總體生存率更低。這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致。此外，該研究還表明PAQR4 mRNA的表達(dá)水平是HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，這說(shuō)明在該研究中所涉及的臨床病理特征中，PAQR4 mRNA的表達(dá)水平對(duì)HCC患者預(yù)后有明顯的影響。由于該研究中所納入的臨床病理特征有限，PAQR4 mRNA的表達(dá)水平在納入更多臨床病理特征的多因素分析中是否仍是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素需要進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步探討PAQR4與肝癌的關(guān)系，該研究通過(guò)構(gòu)建PAQR4過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞株，結(jié)果提示過(guò)表達(dá)PAQR4可顯著促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，與此同時(shí)，PI和Annexin V雙染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明過(guò)表達(dá)PAQR4對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡起抑制作用。Wu et al[7]的研究表明過(guò)表達(dá)PAQR4促進(jìn)A549肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。過(guò)表達(dá)PAQR4能夠促進(jìn)PC53和DU145前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換[9]。在胃癌中miR-370的直接作用靶點(diǎn)在PAQR4的3′UTR，miR-370的敲除會(huì)導(dǎo)致SGC7901胃癌細(xì)胞中PAQR4的表達(dá)量增加；與此同時(shí)，過(guò)表達(dá)PAQR4能夠逆轉(zhuǎn)miR-370對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換[10]。國(guó)內(nèi)外研究均提示PAQR4過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，這與該研究結(jié)果相同。以上提示PAQR4有可能成為預(yù)測(cè)HCC的候選生物標(biāo)志物。

綜上所述，該研究初步探討了PAQR4基因?qū)CC患者預(yù)后影響及其在HepG2細(xì)胞中的作用，證明了PAQR4在HCC組織中高表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)，過(guò)表達(dá)PAQR4促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，且過(guò)表達(dá)PAQR4抑制HepG2細(xì)胞的凋亡。PAQR4有可能成為HCC診斷和預(yù)后的新標(biāo)志物。