王瑪麗, 李 奇, 楊佳佳, 廖 敏, 操海群, 趙 寧

(作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，安徽農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，合肥 230036)

看麥娘Alopecurus aequalis是我國農(nóng)田常見惡性雜草之一，主要分布在黃河及長江中下游流域等地區(qū)稻茬麥田及油菜田，其整株分蘗旺盛、群體競爭能力強，可導(dǎo)致作物嚴重減產(chǎn)甚至絕收[1]，目前主要使用甲基二磺隆、精噁唑禾草靈、異丙隆等化學除草劑對其進行防除。甲基二磺隆屬于乙酰乳酸合成酶 (ALS) 抑制劑中的磺酰脲類除草劑，其作用靶標為ALS。ALS 能夠催化植物體內(nèi)支鏈氨基酸合成反應(yīng)的第一步，是多種不同化學類別除草劑的共同靶標[2]。由于ALS 抑制劑類除草劑殺草譜廣、安全、高效且毒性較低，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，但由于其作用位點單一，長期重復(fù)使用極易導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗藥性[3]。據(jù)統(tǒng)計，截至2021年5 月，全球已有167 種雜草生物型對ALS 抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗性，其中17 種來自于中國[4]。

雜草對除草劑的抗性機制主要包括兩個方面：一是靶標基因突變或過量表達導(dǎo)致的靶標抗性，二是雜草對除草劑的隔離、傳導(dǎo)能力改變或者代謝能力增強導(dǎo)致的非靶標抗性[5-6]。據(jù)報道，ALS基因5 個保守區(qū)第122 位、第197 位、第205 位、第376 位、第377 位、第574 位、第653位和第654 位8 個氨基酸位點發(fā)生突變是雜草對ALS 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的主要原因之一[7-8]。同時，關(guān)于雜草對ALS 抑制劑代謝能力增強所致抗性的報道也逐漸增多[9]。其中，細胞色素P450s、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 、糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-GT) 等活性的增強是雜草對除草劑產(chǎn)生代謝抗性的重要原因[10]。

近年來，我國江蘇、安徽、山東等省部分地區(qū)農(nóng)戶普遍反映，多種常用除草劑在大田推薦劑量下已無法對看麥娘等禾本科雜草進行有效防控，即看麥娘可能產(chǎn)生了抗藥性。2018 年，Guo等[11]對黃河及長江中下游流域采集的47 個看麥娘種群進行抗藥性檢測，發(fā)現(xiàn)多個種群已對甲基二磺隆產(chǎn)生高水平抗性，而ALS基因第197 位和第574 位氨基酸位點突變是導(dǎo)致抗性產(chǎn)生的主要原因之一。關(guān)于抗藥性看麥娘的防治目前已成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題。

2020 年5 月，本課題組在安徽省鳳臺縣進行田間雜草抗藥性調(diào)查過程中，采集到一個看麥娘疑似抗性種群AHFT-01，該種群所在地塊使用甲基二磺隆已無法對其進行有效防治。為明確其抗藥性發(fā)生情況及可能存在的抗性機制，本研究首先在整株水平上測定了AHFT-01 對甲基二磺隆的敏感性，并對抗性和敏感種群ALS基因進行了擴增、測序和比對，以明確AHFT-01 對甲基二磺隆的抗性水平及其抗性產(chǎn)生的靶標分子機制，同時測定了該種群對不同ALS 抑制劑的交互抗性，以及對乙酰輔酶A 羧化酶 (ACCase) 及光合系統(tǒng)II(PSII) 抑制劑類除草劑的多抗性，以期為小麥田抗性看麥娘的防治及減緩其抗藥性發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 雜草種子 看麥娘Alopecurus aequalis疑似抗性種群AHFT-01 采集自安徽省淮南市鳳臺縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園小麥田 (32.57°N，117.65°) ，該地塊已連續(xù)多年使用甲基二磺隆進行雜草防除；敏感種群AHHN-02 為實驗室保存株系，采集自安徽省淮南市大通區(qū)九龍崗鎮(zhèn)曹店村非耕地 (32.63°N，117.13°E) ，該地塊從未使用過除草劑。

1.1.2 藥劑與試劑 30 g/L 甲基二磺隆 (mesosulfuronmethyl) 可分散油懸浮劑 (OD) 及69 g/L 精噁唑禾草靈 (fenoxaprop-P-ethyl) 水乳劑 (EW) ，拜耳作物科學 (中國) 有限公司；240 g/L 烯草酮 (clethodim)乳油 (EC) ，山東奧坤作物科學股份有限公司；10% 唑啉草酯 (pinoxaden) OD 及5% 氟唑磺隆(flucarbazone-sodium) OD，安徽尚禾沃達生物科技有限公司；5%咪唑乙煙酸 (imazethapyr) 水劑(AS) ，南通金陵農(nóng)化有限公司；7.5%啶磺草胺(pyroxsulam) 水分散粒劑 (WG) ，科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責任公司；50%異丙隆 (isoproturon) 可濕性粉劑 (WP) ，安徽廣信農(nóng)化股份有限公司。DNA提取試劑盒，江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；DNA 回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 T100 型梯度PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；萬分之一電子天平，上海越平科學儀器 (蘇州) 制造有限公司；ERS 200 電泳儀，北京原平皓生物技術(shù)有限公司；GL21M 臺式高速冷凍離心機，凱達科學儀器有限公司；BIC-400 人工氣候箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；3WP-2000 型行走式噴霧塔，農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機械化研究所；ZF-288 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 看麥娘對甲基二磺隆的抗性水平測定 采用溫室盆栽法[12]在整株水平上進行測定。選取顆粒飽滿的看麥娘AHFT-01 和AHHN-02 種群種子，分別置于直徑9 cm、墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，添加純水保濕；置于光照培養(yǎng)箱中，于25 ℃/20 ℃、12 h/12 h 光周期條件下催芽。將土壤和有機質(zhì)按1 : 1 質(zhì)量比混勻，填入長 (寬) 7 cm、高7 cm的方形塑料盆缽內(nèi)，壓實后放入接水托盤。于托盤底部澆水，待塑料盆缽中土壤完全浸濕后播種。待看麥娘種子萌芽至1 cm 左右，選取10 株轉(zhuǎn)移至填有壤土的塑料盆缽，置于光照培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待看麥娘生長至2 ～ 3 葉期時間苗，保留6 株長勢一致的幼苗；至3 ～ 4 葉期時采用行走式噴霧塔進行莖葉噴霧處理，噴頭距植株葉片約50 cm，噴液壓力275 kPa，噴液量450 L/hm2。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置甲基二磺隆施用劑量，以噴施清水為空白對照 (表1) 。于施藥后21 d 剪取看麥娘地上部分，稱量并記錄鮮重。每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)1 盆，整個試驗重復(fù)2 次。

表1 看麥娘種群敏感性測定中各除草劑施用劑量Table 1 Herbicide doses used for determining the susceptibilities of Alopecurus aequalis populations

1.2.2 看麥娘抗性、敏感種群ALS基因序列擴增

DNA 提?。捍贷溎镉酌缗囵B(yǎng)至3 ～ 4 葉期時，從AHFT-01 和AHHN-02 種群中隨機選取10 個單株，每株剪取約50 mg 幼嫩葉片組織，根據(jù)植物DNA 提取試劑盒使用說明提取其基因組DNA，于 ?20℃冰箱保存，備用。

引物合成：參考Iwakami 等[13]報道的引物序列 (表2) ，由北京擎科生物科技有限公司進行引物合成。所用引物對能夠擴增看麥娘ALS基因不同拷貝全長序列，且包含已報道的8 個ALS基因氨基酸突變位點。

表2 ALS 基因全長序列擴增引物Table 2 Primers used for amplifying the full-length ALS genes

PCR 擴增體系為50 μL，分別包含：2 × Es Taq MasterMix 25 μL、ddH2O 20 μL、10 μmol/L 正向引物2 μL、10 μmol/L 反向引物2 μL 和基因組DNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s，58 ～ 63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33 個循環(huán)；最后于72℃終延伸10 min。

1.2.3ALS基因序列差異分析 將PCR 擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，切取目的片段，使用DNA 回收試劑盒對目的基因進行回收純化，然后送擎科生物科技有限公司測序，測序引物為PCR 擴增引物?？贷溎顰LS 氨基酸序列編號以模式植物擬南芥Arabidopsis thalianaALS 全長序列為標準，使用DNAMAN 6.0.3 軟件分別對疑似抗性種群AHFT-01 和敏感種群AHHN-02 的ALS基因序列進行比對，分析其ALS基因序列差異。

1.2.4 看麥娘種群對不同除草劑的敏感性測定

按照1.2.1 節(jié)所述方法，分別測定看麥娘疑似抗性種群AHFT-01 和敏感種群AHHN-02 對ALS 抑制劑類除草劑咪唑乙煙酸、啶磺草胺、氟唑磺隆，ACCase 抑制劑類除草劑精噁唑禾草靈、烯草酮、唑啉草酯，以及PSII 抑制劑類除草劑異丙隆的敏感性水平，各除草劑具體施藥劑量見表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 藥劑處理后21 d，剪取看麥娘地上部分并稱量鮮重，按照公式 (1) 計算相對鮮重。

式中：y為相對鮮重；mt為處理組雜草平均鮮重，g；m0為空白對照組雜草平均鮮重，g。

采用SPSS v.19.0 軟件的一般線性模型對重復(fù)試驗數(shù)據(jù)進行組間方差分析，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)間無顯著差異 (P> 0.05) 。將重復(fù)試驗數(shù)據(jù)合并，采用SigmaPlot v.12.5 軟件四參數(shù)雙邏輯非線性回歸模型 (2) 進行數(shù)據(jù)處理，繪制劑量響應(yīng)曲線，并計算抑制雜草生長50%所需的除草劑劑量(GR50，g/hm2) 。

式中：yx為特定除草劑用量x下雜草的相對鮮重，%；C為劑量反應(yīng)下限；D為劑量反應(yīng)上限；b為斜率。

按照公式 (3) 計算種群的抗性倍數(shù) (resistance index, RI) 。

式中：GR50(R)為抗性種群雜草GR50值，g/hm2；GR50(S)為敏感種群雜草GR50值，g/hm2。

抗性水平分級標準[14]：RI<2，敏感；2≤RI<5，低抗；5≤RI<10，中抗；RI≥10，高抗。

2 結(jié)果與分析

2.1 看麥娘種群對甲基二磺隆的抗性水平

采用甲基二磺隆按大田推薦劑量處理后，AHFT-01 種群所有植株均可正常生長，而AHHN-02 種群植株均枯萎死亡，表明AHFT-01 種群已對甲基二磺隆產(chǎn)生了抗性。根據(jù)整株劑量響應(yīng)曲線可得，甲基二磺隆對AHFT-01 和AHHN-02 種群的GR50值分別為有效成分44.74 和1.57 g/hm2，表明AHFT-01 對甲基二磺隆產(chǎn)生了高水平抗性，其抗性倍數(shù)為28.50 (表3) 。

表3 看麥娘種群對甲基二磺隆的抗性水平Table 3 Resistance index to mesosulfuron-methyl of different Alopecurus aequalis populations

2.2 看麥娘抗性和敏感種群ALS 基因序列差異

對看麥娘不同種群ALS基因進行擴增，共得到ALS1、ALS2、ALS3和ALS44 個基因拷貝。其中，ALS1和ALS2在所有植株DNA 中均得到了擴增產(chǎn)物，而ALS3和ALS4僅在部分植株DNA 中可擴增到，且ALS3和ALS4存在單堿基缺失導(dǎo)致的移碼錯位，氨基酸翻譯異常，被鑒定為假基因[13]。因此本研究僅分析不同種群ALS1和ALS2的序列差異。

本研究中，ALS1和ALS2序列長度均為1917 bp，共編碼639 個氨基酸，包含已報道的8 個能夠?qū)е码s草對除草劑產(chǎn)生抗性的氨基酸位點。序列比對結(jié)果顯示：AHHN-02 種群ALS不同拷貝已知位點均未發(fā)生突變；與AHHN-02 相比，AHFT-01ALS1第197 位氨基酸由脯氨酸Pro (CCC) 突變?yōu)樘K氨酸Thr (ACC) ，且測定的10 個單株ALS1均發(fā)生了純合突變，突變頻率為100%，其余7 個位點及ALS28 個位點則均未發(fā)生任何突變 (表4) 。

表4 不同看麥娘種群ALS1 基因部分序列Table 4 Partial sequences of ALS1 genes from different Alopecurus aequalis populations

2.3 看麥娘抗性種群對其他不同除草劑的敏感性

看麥娘AHFT-01 和AHHN-02 種群對不同除草劑的劑量響應(yīng)曲線如圖1 所示。正如預(yù)期，敏感種群AHHN-02 在所有測試藥劑大田推薦劑量處理下均發(fā)生了死亡，與之相比，抗性種群AHFT-01對ALS 抑制劑類的啶磺草胺及氟唑磺隆產(chǎn)生了高水平抗性，抗性倍數(shù)分別為10.15 和10.13；對咪唑乙煙酸產(chǎn)生了中等水平抗性，抗性倍數(shù)為8.18(表5) 。

圖1 看麥娘不同種群對8 種除草劑的敏感性水平Fig. 1 The susceptibility levels of different Alopecurus aequalis populations to eight herbicides

同時，本研究還測定了不同種群看麥娘對ACCase 和PSII 抑制劑類除草劑的多抗性，相比AHHN-02，AHFT-01 種群對唑啉草酯同時產(chǎn)生了低水平抗性 (RI = 2.27) ，對精噁唑禾草靈、烯草酮及異丙隆則依舊較為敏感 (RI<2) (表5) 。

表5 看麥娘不同種群對其他除草劑的敏感性水平Table 5 The susceptibility levels of different Alopecurus aequalis populations to other herbicides

3 討論與結(jié)論

ALS 抑制劑是目前世界上應(yīng)用最為廣泛的除草劑種類之一，其除草活性高、安全性好，但是長期大量重復(fù)使用容易導(dǎo)致雜草抗藥性的快速發(fā)生和蔓延[15]。有研究表明，ALS 抑制劑類除草劑使用不到10 次就會導(dǎo)致雜草對其產(chǎn)生抗性[14]。截至目前，全世界范圍內(nèi)已有167 種雜草生物型對ALS 抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗性，例如澳大利亞的硬直黑麥草Lolium rigidum[16]和野薺菜Raphanus raphanistrum[17]、加拿大的地膚Kochia scoparia[18]和長芒莧Amaranthus tuberculatus[19]、中國的日本看麥娘Alopecurus japonicus[20]等。本研究中，從安徽省鳳臺縣采集的看麥娘種群AHFT-01 也已經(jīng)對甲基二磺隆產(chǎn)生高水平抗性 (RI > 10) ，而根據(jù)記錄，該種群所在地塊已連續(xù)多年使用ALS 抑制劑類除草劑進行雜草防除。這再一次印證了單一作用機制除草劑長期大量重復(fù)使用是導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。

據(jù)報道，大部分ALS 抑制劑類除草劑抗性案例是由于ALS 發(fā)生氨基酸突變引起的，氨基酸突變導(dǎo)致靶標酶構(gòu)象改變，進而阻礙除草劑與靶標的結(jié)合[21]。迄今為止，已經(jīng)在多種雜草中發(fā)現(xiàn)ALS基因8 個位點可以發(fā)生多種氨基酸突變形式。例如，ALS基因Ala-122-Tyr 突變是澳大利亞野薺菜種群對氯磺隆、磺草唑胺、甲氧咪草煙產(chǎn)生抗性的主要原因[22]；Pro-197-Thr 和Trp-574-Leu兩種ALS基因突變是我國山東省播娘蒿Descurainia sophia種群對ALS 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一[23]；Trp-574-Leu 和Ala-205-Val 兩種ALS基因突變導(dǎo)致了黑龍江省反枝莧Amaranthus retroflexus種群對噻吩磺隆和氟磺胺草醚的抗性[24]。第197 位和第574 位是ALS基因最常見的突變位點[15]，其中第197 位已發(fā)現(xiàn)至少13 種氨基酸突變形式，包括Pro-197-Arg、Pro-197-Ser 和Pro-197-Thr 等[25-26]。Bi 等[27]報道，ALS基因Pro-197-Thr 突變是日本看麥娘對甲基二磺隆產(chǎn)生抗性的原因；Zhao 等[28]報道，ALS1基因Pro-197-Tyr 突變是看麥娘對甲基二磺隆產(chǎn)生抗性的重要靶標分子機制。本研究中，看麥娘種群AHFT-01 的ALS1基因發(fā)生了Pro-197-Thr 純合突變，且突變發(fā)生頻率高達100%，表明ALS1基因第197 位突變也是AHFT-01 對甲基二磺隆產(chǎn)生高水平抗性的重要原因之一。

不同突變位點或同一位點的不同突變形式，會導(dǎo)致雜草產(chǎn)生不同的交互抗性譜[29-30]。據(jù)報道，ALS基因第197 位氨基酸突變通常會導(dǎo)致對磺酰脲類除草劑的抗性[31]。Xia 等[2]報道，看麥娘種群JTJY-1 對磺酰脲類和三唑并嘧啶類除草劑具有中等或較高水平交互抗性，對咪唑啉酮類抗性水平較低；而看麥娘種群JHHZ-1 則對上述3 種類別的ALS 抑制劑均具有抗性；兩個種群的ALS基因分別檢測出了Pro-197-Thr 和Trp-574-Leu 突變，但是該研究并未表明突變具體發(fā)生在ALS的哪個拷貝上。本研究中，ALS1基因發(fā)生Pro-197-Thr突變的看麥娘種群AHFT-01 對3 種不同類別的ALS 抑制劑類除草劑均產(chǎn)生了高水平或中等水平的交互抗性，這與前人的報道結(jié)果相似[2]，但是也存在一定差異，這可能是由于種群用藥歷史背景存在差異等原因所致[29]。

本研究鑒定得到的看麥娘種群AHFT-01 對常用ALS 抑制劑類除草劑均產(chǎn)生了抗藥性，已嚴重威脅到小麥的安全生產(chǎn)，因此，本研究同時測定了該種群對ACCase 抑制劑類和PSII 抑制劑類除草劑的敏感性，以期發(fā)現(xiàn)可用于該抗性種群看麥娘防治的藥劑。結(jié)果表明，AHFT-01 對ACCase抑制劑唑啉草酯也產(chǎn)生了低水平抗性，但是對其他ACCase 抑制劑如精噁唑禾草靈、烯草酮以及PSII 抑制劑異丙隆依舊敏感，因此在實際生產(chǎn)中，仍可采用精噁唑禾草靈和異丙隆繼續(xù)對該小麥田抗性看麥娘進行有效防控。此外，將化學藥劑防治與輪作、深翻耕等農(nóng)業(yè)措施相結(jié)合，是延緩看麥娘等農(nóng)田惡性雜草產(chǎn)生抗藥性的有效措施之一。