郭兵博, 蔣標(biāo)標(biāo), 董雅雯, 金小宇,崔 麗, 張 莉*,, 楊新玲*,

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系 農(nóng)藥創(chuàng)新研究中心，北京 100193；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193)

昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 (insect growth regulators, 簡(jiǎn)稱IGRs) 是一類高效、低毒、具有高選擇性且對(duì)環(huán)境安全的特異性殺蟲劑，被譽(yù)為21 世紀(jì)的理想農(nóng)藥。根據(jù)IGRs 的作用機(jī)制和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，主要分為蛻皮激素及其類似物、幾丁質(zhì)及其抑制劑、保幼激素及其類似物[1-2]。其中蛻皮激素類似物通過與蛻皮激素受體 (EcR) 和超氣門蛋白 (USP)形成異質(zhì)二聚體導(dǎo)致昆蟲過早蛻皮而死亡[3-4]。含有雙酰肼 (DBHs) 結(jié)構(gòu)的化合物如蟲酰肼 (tebufenozide) 、甲氧蟲酰肼 (methoxyfenozide) 和氯蟲酰肼 (halofenozide) (圖式1) 等是一類重要的非甾類蛻皮激素類似物，其發(fā)揮活性的重要基團(tuán)為雙酰肼結(jié)構(gòu)，它們以EcR 為作用靶標(biāo)，對(duì)鱗翅目昆蟲具有良好的殺蟲活性，能夠誘導(dǎo)幼蟲快速拒食和過早蛻皮，干擾正常的角質(zhì)層并導(dǎo)致死亡，并且對(duì)哺乳動(dòng)物和環(huán)境友好[5-7]。非甾類蛻皮激素激動(dòng)劑具有優(yōu)異的特性，但由于化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架單一，長(zhǎng)期使用后昆蟲對(duì)其已經(jīng)產(chǎn)生抗性[8-10]。因此，對(duì)蛻皮激素激動(dòng)劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造是獲得新型高活性蛻皮激素化合物的一條成功途徑[11]。

吡唑并環(huán)結(jié)構(gòu)類化合物具有殺蟲、抑菌等生物活性[12-13]。Okada 等報(bào)道了一系列含吡唑并環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，如A (圖式1) 對(duì)小菜蛾P(guān)lutella xylostella具有較好的殺蟲活性[12]。本課題組對(duì)吡唑并環(huán)類化合物也進(jìn)行了一定的研究，首先基于EcR 亞基活性位點(diǎn)的構(gòu)象相似性，發(fā)現(xiàn)了一種含叔丁基取代的吡唑環(huán)化合物B (3-(叔丁基)-N-( 4- (叔丁基)苯基-1-苯基-1H-吡唑-5-甲酰胺) (圖式1) ，其對(duì)小菜蛾表現(xiàn)出良好的活性，在EcR 活性位點(diǎn)的結(jié)合口袋中和蟲酰肼有相似的結(jié)合模式，表明B 可能是蛻皮激素類似物[14]；隨后將B 吡唑環(huán)上的叔丁基改為七元環(huán)以增強(qiáng)其疏水性，發(fā)現(xiàn)了化合物C (N-(4-(叔丁基)苯基)-2-苯基-2,4,5,6,7,8-六氫環(huán)庚基[C]吡唑-3-甲酰胺) (圖式1) ，其在200 mg/L 下對(duì)小菜蛾的致死率為94%，蛋白結(jié)合試驗(yàn)和分子對(duì)接表明，C 能作用于EcR，與蟲酰肼具有相似的結(jié)合模式，并且由于吡唑并環(huán)具有較強(qiáng)的疏水作用，占據(jù)了EcR 重要的疏水位置，對(duì)化合物活性的保持具有重要意義，是一類值得研究的新型IGRs 先導(dǎo)分子[15]。

圖式 1 蟲酰肼、甲氧蟲酰肼、氯蟲酰肼、氰氟蟲腙、A、B、C 和D 的結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Chemical structures of tebufenozide, methoxyfenozide, halofenozide, metaflumizone, A, B, C and D

此外，各大農(nóng)藥公司近年來開發(fā)出許多新型含氨基脲和氨基硫脲類化合物，如德國巴斯夫公司和日本農(nóng)藥公司聯(lián)合開發(fā)的橋鏈含有氨基脲結(jié)構(gòu)的氰氟蟲腙 (metaflumizone，圖式1) ，可以有效防治各種鱗翅目害蟲 (如小菜蛾等) 及某些鞘翅目害蟲的幼蟲和成蟲[16]；先正達(dá)公司開發(fā)的橋鏈含有氨基硫脲結(jié)構(gòu)的化合物D，對(duì)鱗翅目昆蟲小菜蛾、?；页嵋苟暧紫x等均具有較好的殺蟲活性[17]。為了尋求高活性的蛻皮激素類似物，本文以化合物C 為先導(dǎo)化合物，通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接的方法，在其橋鏈部分引入氨基脲和氨基硫脲，以探討其結(jié)構(gòu)改變對(duì)殺蟲活性的影響。目標(biāo)化合物I 的設(shè)計(jì)思路如圖式2 所示。

圖式 2 目標(biāo)化合物I 的分子設(shè)計(jì)思路Scheme 2 Design strategies of the target compounds I

本工作以環(huán)己酮為起始原料，通過克萊森酯縮合反應(yīng)、Knorr 吡唑合成反應(yīng)和親核加成反應(yīng)等合成方法得到一系列未見文獻(xiàn)報(bào)道的目標(biāo)化合物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)過核磁共振氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR)和高分辨質(zhì)譜(HRMS)確證，從分子對(duì)接和蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)角度揭示目標(biāo)化合物與EcR 的結(jié)合能力，并對(duì)其殺蟲活性和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步研究。目標(biāo)化合物的合成路線如圖式3所示。

圖式 3 目標(biāo)化合物 I-01 ～ I-25 的合成路線Scheme 3 Synthetic routes of the target compounds I-01-I-25

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與供試材料

FTICR-MS 7.0 質(zhì)譜儀(美國瓦里安公司)；Bruker Avance 300 型和Bruker Avance 600 型核磁共振儀(德國B r u k e r 公司)，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)；X-5 型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)試儀(北京富凱有限公司)；閃爍計(jì)數(shù)器 (Hidex-300SL, 2 min/filter, 芬蘭Hidex 公司)。柱層析硅膠，青島海洋化工廠；[3H] PonA(tritiated PonA, 95 Ci/mmol，美國PerkinElmer 公司。Ci (居里)為放射性活度原用單位，國際單位為貝克Bq，1 Ci = 3.7 × 1010Bq)；硝酸纖維素膜(NC45，德國Merck Millipore公司)；Aquasol-2 玻璃小瓶(美國PerkinElmer 公司)；其他試劑均為市售化學(xué)純和分析純。蟲酰肼原藥(純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

小菜蛾P(guān)lutella xylostella，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所崔麗課題組提供。

1.2 化合物合成

1.2.1 中間體化合物的合成 中間體2、3 和4 參照文獻(xiàn)方法合成[18-21]。

1.2.2 目標(biāo)化合物I-01～I(xiàn)-25 的合成 以目標(biāo)化合物I-25 的合成為例：參照文獻(xiàn)方法[22], 向中間體4(0.50 g, 1.95 mmol)和對(duì)甲氧基苯基異硫氰酸酯(0.64 g, 3.90 mmol)中加入20 mL 無水乙醇，加熱回流，薄層層析[TLC,V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1] 監(jiān)測(cè)至化合物4 反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)。抽濾，用少量無水乙醇洗滌，濾餅干燥，得到白色固體I-25 (0.74 g, 90%)。同法制備其余目標(biāo)化合物。

1.3 分子對(duì)接

從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫獲取EcR 的晶體結(jié)構(gòu)復(fù)合物 (PDB ID：3IXP)，使用MMFF94 力場(chǎng)和電荷對(duì)化合物均進(jìn)行構(gòu)建和優(yōu)化 (未去掉配體小分子) ，選擇每種化合物的低能構(gòu)象作為初始對(duì)接構(gòu)象。每個(gè)配體分子保留30 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，保留得分最低的構(gòu)象以進(jìn)一步探究配體與蛋白質(zhì)的相互作用。采用Molecular Operating Environment (MOE 2018.01)[23]建模軟件進(jìn)行分子對(duì)接，獲得相應(yīng)的打分值(Score) 。

1.4 EcR/USP 蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法[24-25]，根據(jù)試劑盒 (Sigma-Aldrich，上海) 提取質(zhì)量濃度超過500 ng/μL 的質(zhì)粒，針對(duì)體外翻譯的小菜蛾蛻皮激素受體 (EcR/USP) (PxEc 和PxUSP) 進(jìn)行 [3H] PonA 放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，具體方法如下：用于配體結(jié)合的反應(yīng)測(cè)試體系共16 μL 混合物，包含3.2 μL 測(cè)試化合物的二甲基亞砜(DMSO) 溶液和4.8 μL[3H]PonA 乙醇溶液，其余均為低鹽緩沖液(buffer)，包含：5 mg/L 重組抑肽酶(aprotinin)、5 mg/L 抑肽素A(pepstatin)、5 mg/L 亮肽素(Leupepton)和100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(BSA) ，在25 °C 下孵育90 min。孵育結(jié)束后，立即將反應(yīng)混合物通過硝酸纖維素膜過濾，并用3 mL 冰冷的洗滌緩沖液洗滌3 次。將該膜轉(zhuǎn)移到裝有2 mL Aquasol-2 的玻璃小瓶中，置于振蕩器中進(jìn)行溶劑化。使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性。每組同時(shí)進(jìn)行3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 殺蟲活性測(cè)定

采用殺蟲劑抗性行動(dòng)委員會(huì)(IRAC)提出的浸葉法測(cè)定[26]。首先，將化合物I-01～I(xiàn)-25 (10 mg)和蟲酰肼 (10 mg) 用1 mL 二甲基亞砜溶解，用含質(zhì)量濃度0.05% 曲拉通(X-100)的水溶液連續(xù)稀釋，配制成500 mg/L 的待測(cè)藥液。將甘藍(lán)葉片在藥液中浸泡3s 后取出。對(duì)照組用含質(zhì)量濃度為0.05%的曲拉通溶液處理。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次(每次重復(fù)用10 只幼蟲)。置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿 (直徑為10 cm) 中, 室溫下干燥。在每個(gè)培養(yǎng)皿中接入2 齡小菜蛾幼蟲10 頭，于 (25 ± 2) °C、相對(duì)濕度為70% ± 20%、光/暗周期為14 h/10 h 的條件下培養(yǎng), 96 h 后記錄幼蟲死亡率。以用刷子接觸幼蟲不能正常移動(dòng)者視為死亡。

分別按公式 (1)和(2) 計(jì)算死亡率(P1)和校正死亡率(P2)。

式中：K為死亡蟲數(shù)；N為處理總蟲數(shù)；P0為空白對(duì)照組的死亡率，%。

1.6 目標(biāo)化合物I-01 ～ I-25 的脂水分配系數(shù)

通過ChemDraw Professional 16.0計(jì)算得到脂水分配系數(shù) (ClogP)[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物合成

以環(huán)己酮和草酸二乙酯為起始原料，在乙醇鈉的作用下發(fā)生克萊森酯縮合反應(yīng)得到六元-β酮酸酯(2)粗品，經(jīng)柱層析分離、減壓蒸餾得到酮酸酯(2)。采用Knorr 吡唑合成法將化合物2 制備成4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-甲酸酯(3)，再經(jīng)過肼解，得到4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-甲酰肼(4)，將中間體4 與相應(yīng)取代的異氰酸酯或異硫氰酸酯通過親核加成反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物I-01 ～ I-25。其結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下。

N-(2-氯苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基) 肼-1-甲酰胺(I-01)：白色固體, 產(chǎn)率90%, m.p. 242-243 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 9.87 (s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.66 (d,J= 7.6 Hz, 2H),7.56 (t,J= 7.9 Hz, 2H), 7.44 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 7.37 (s, 1H),7.27 (t,J= 8.1 Hz, 1H), 7.01 – 6.97 (m, 1H), 2.79 – 2.69 (m,4H), 1.78 – 1.69 (m, 4H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ:162.8, 142.1, 141.9, 140.6, 139.5, 133.5, 130.7, 129.8, 128.1,123.8, 121.8, 119.6, 118.3, 117.3, 56.5, 23.3, 22.7, 22.5, 21.7,19.0. HRMS(ESI): C21H20ClN5O2[M + H]+, 測(cè)量值410.1378, 計(jì)算值410.1380.

N-(3-氯苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺 (I-02)： 白色固體，產(chǎn)率87%, m.p. 228-229 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.23 (s, 1H), 9.14(s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.72 (t,J= 1.9 Hz, 1H), 7.59 – 7.52 (m,2H), 7.45 – 7.28 (m, 5H), 7.07 – 7.00 (m, 1H), 2.76 (t,J=5.4 Hz, 2H), 2.69 (t,J= 5.4 Hz, 2H), 1.86 – 1.67 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ: 161.0, 155.1, 149.3, 141.4,139.9, 133.3, 132.1, 130.5, 128.9, 126.8, 122.9, 121.7, 119.2,117.8, 116.9, 60.6, 22.9, 22.8, 22.7, 20.5, 14.6. HRMS(ESI):C21H20ClN5O2[M + H]+, 測(cè)量值410.1378, 計(jì)算值410.1371.

N-(4-氯苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺 (I-03)：白色固體，產(chǎn)率93%, m.p. 225-226 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ:10.22 (s, 1H), 9.05(s, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.55 (t,J= 7.8 Hz, 4H), 7.41 (t,J=7.7 Hz, 2H), 7.37 – 7.27 (m, 3H), 2.72 (dt, J = 11.1, 6.0 Hz,4H), 1.89 – 1.66 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ:161.0, 155.2, 149.3, 139.9, 138.8, 132.1, 128.9, 128.7, 126.8,125.6, 122.9, 120.0, 119.2, 22.9, 22.8, 22.7, 20.5. HRMS(ESI):C21H20ClN5O2[M + H]+, 測(cè)量值410.1378, 計(jì)算值410.1372.

N-(2-甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺 (I-04)：白色固體，產(chǎn)率85%, m.p. 241-242 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 10.19 (s, 1H), 8.76(s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.56 – 7.52 (m, 2H), 7.40 (t,J= 7.8 Hz,2H), 7.34 – 7.22 (m, 3H), 7.18 – 7.10 (m, 1H), 6.79 (d,J=7.5 Hz, 1H), 2.74 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 2.67 (t,J= 6.0 Hz,2H), 2.27 (s, 3H), 1.83 – 1.76 (m, 2H), 1.75 – 1.68 (m, 2H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 161.4, 155.6, 149.7, 140.2,140.0, 138.4, 132.5, 129.3, 129.1, 127.2, 123.8, 123.2, 123.1,119.5, 119.3, 116.0, 23.3, 23.2, 23.0, 21.7, 20.8. HRMS(ESI): C22H23N5O2[M + H]+, 測(cè)量值390.1925, 計(jì)算值390.1926.

N-(3-甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺(I-05)：白色固體，產(chǎn)率93%, m.p. 215-216 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 9.81 (s, 1H), 8.68(s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.66 (d,J= 7.8 Hz, 2H), 7.55 (t,J=7.8 Hz, 2H), 7.44 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 7.36 (d,J= 8.2 Hz, 2H),7.06 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 2.79 – 2.68 (m, 4H), 2.23 (s, 3H),1.78 – 1.66 (m, 4H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ:162.8, 142.1, 140.5, 139.5, 137.7, 131.0, 129.8, 129.6, 129.5,128.1, 123.7, 119.6, 118.9, 60.5, 23.4, 22.7, 22.5, 21.7, 20.8,15.0. HRMS(ESI): C22H23N5O2[M + H]+, 測(cè)量值390.1925,計(jì)算值390.1919.

N-(4-甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺(I-06)：白色固體，產(chǎn)率90%, m.p. 235-236 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 10.33 (s, 1H), 8.90(s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.09 (dd,J= 7.9, 1.2 Hz, 1H), 7.51 (d,J= 7.8 Hz, 2H), 7.41 (t,J= 7.9 Hz, 2H), 7.30 (t,J= 7.4 Hz,1H), 7.03 – 7.00 (m, 1H), 6.95 (td,J= 7.8, 1.5 Hz, 1H), 6.90(td,J= 7.9, 1.0 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 2.74 (t,J= 5.8 Hz, 2H),2.67 (t,J= 5.8 Hz, 2H), 1.83 – 1.70 (m, 4H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 161.5, 155.4, 149.7, 148.0, 140.2, 132.3,129.3, 128.8, 127.3, 123.2, 122.5, 121.1, 119.5, 118.7, 111.2,56.2, 23.3, 23.2, 23.0, 20.8. HRMS(ESI): C22H23N5O2[M +H]+, 測(cè)量值390.1925, 計(jì)算值: 390.1917.

N-(2-甲氧基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺 (I-07)：白色固體，產(chǎn)率86%, m.p. 233-234 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 10.20 (s, 1H), 8.89(s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.55 (dd,J= 8.4, 0.9 Hz, 2H), 7.39 (t,J=7.8 Hz, 2H), 7.30 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 7.17 (dd,J= 9.4, 6.9 Hz,2H), 7.03 – 6.98 (m, 1H), 6.55 (dd,J= 8.0, 2.2 Hz, 1H), 3.73(s, 3H), 2.74 (t,J= 6.1 Hz, 2H), 2.67 (t,J= 6.1 Hz, 2H), 1.83 –1.69 (m, 4H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 161.4,160.1, 155.5, 149.6, 141.3, 140.2, 132.4, 130.0, 129.2, 127.2,123.2, 119.5, 111.1, 107.7, 104.6, 55.4, 23.3, 23.2, 23.0, 20.9.HRMS(ESI): C22H23N5O3[M + H]+, 測(cè)量值406.1874, 計(jì)算值406.1865.

N-(3-甲氧基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺 (I-08)：白色固體，產(chǎn)率87%, m.p. 218-219 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 9.79 (d,J= 1.1 Hz,1H), 8.58 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.66 (d,J= 7.5 Hz, 2H), 7.55(t,J= 7.9 Hz, 2H), 7.44 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 7.37 (d,J= 9.0 Hz, 2H), 6.87 – 6.81 (m, 2H), 3.70 (s, 3H), 2.78 – 2.68 (m,4H), 1.77 – 1.68 (m, 4H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ:162.8, 156.2, 154.9, 142.2, 140.5, 139.5, 133.3, 129.8, 128.1,123.7, 120.6, 119.58, 114.38, 114.3, 55.6, 23.4, 22.8, 22.5,21.7, 19.0. HRMS(ESI): C22H23N5O3[M + H]+, 測(cè)量值406.1874, 計(jì)算值406.1866.

N-(4-甲氧基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺(I-09)：白色固體，產(chǎn)率82%, m.p. 233-234 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.18 (s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.60 – 7.53 (m, 2H), 7.45 – 7.36 (m, 4H),7.31 (t,J= 7.3 Hz, 1H), 6.92 – 6.85 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.75(t,J= 5.7 Hz, 2H), 2.68 (t,J= 5.7 Hz, 2H), 1.86 – 1.68 (m,4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ: 161.1, 155.5, 154.7,149.3, 139.9, 132.8, 132.2, 128.9, 126.8, 122.9, 120.3, 119.1,114.1, 55.3, 22.9, 22.8, 22.7, 20.5. HRMS(ESI): C22H23N5O3[M + H]+, 測(cè)量值406.1874, 計(jì)算值406.1866.

N-(4-乙基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺(I-10)：白色固體，產(chǎn)率85%, m.p. 234-235 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.18 (s, 1H), 8.90(s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.61 – 7.53 (m, 2H), 7.43 – 7.37 (m, 4H),7.32 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 7.13 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 2.76 (t,J=5.6 Hz, 2H), 2.69 (t,J= 5.6 Hz, 2H), 2.57 (dd,J= 9.7, 5.4 Hz,2H), 1.88 – 1.67 (m, 4H), 1.17 (t,J= 7.6 Hz, 3H).13C NMR(75 MHz, DMSO-d6),δ: 161.1, 156.3, 155.3, 149.3, 139.9,137.4, 137.2, 128.9, 128.0, 126.8, 122.9, 119.1, 118.6, 27.7,22.9, 22.7, 20.5, 15.9. HRMS(ESI): C23H25N5O2[M + H]+, 測(cè)量值404.2081, 計(jì)算值404.2074.

N-(3,5-二甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺 (I-11)：白色固體，產(chǎn)率78%, m.p. 250-251 ℃.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6),δ: 9.81 (s, 1H), 8.07(s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.66 (dd,J= 8.5, 1.0 Hz, 2H), 7.54 (t,J=7.9 Hz, 2H), 7.42 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 7.05 – 6.99 (m, 3H), 2.77– 2.70 (m, 4H), 2.20 (s, 6H), 1.78 – 1.67 (m, 4H).13C NMR(151 MHz, DMSO-d6),δ: 162.8, 156.9, 142.3, 140.4, 139.6,136.4, 135.9, 129.8, 128.0, 128.0, 126.3, 123.7, 119.55, 23.4,22.8, 22.5, 21.7, 18.7. HRMS(ESI): C23H25N5O2[M + H]+, 測(cè)量值404.2081, 計(jì)算值404.2073.

N-(2,6-二甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-甲酰胺(I-12)：白色固體，產(chǎn)率72%, m.p. 247-248 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.14 (s, 1H), 8.33(s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.62 – 7.50 (m, 2H), 7.47 – 7.24 (m, 3H),7.08 (s, 3H), 2.74 (t,J= 5.6 Hz, 2H), 2.68 (t,J= 5.8 Hz, 2H),2.20 (s, 6H), 1.86 – 1.64 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSOd6),δ: 161.1, 156.2, 149.2, 139.9, 136.1, 135.4, 132.2, 128.8,127.8, 126.7, 126.2, 122.9, 119.2, 22.9, 22.8, 22.7, 20.5, 18.3.HRMS(ESI): C23H25N5O2[M + H]+, 測(cè)量值404.2081,計(jì)算值404.2074.

N-苯基-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-13)：白色固體，產(chǎn)率92%, m.p. 191-192 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.37 (s, 1H), 9.83 (s, 2H),7.59 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 7.51 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 7.45 – 7.24(m, 5H), 7.18 (t,J= 7.1 Hz, 1H), 2.83 (t,J= 4.9 Hz, 2H), 2.68(t,J= 5.3 Hz, 2H), 1.91 – 1.58 (m, 4H).13C NMR (75 MHz,DMSO-d6),δ: 181.3, 161.9, 141.8, 140.2, 139.5, 139.3, 139.1,129.5, 128.3, 128.1, 127.8, 124.8, 123.4, 119.5, 23.1, 22.4,22.2, 21.4. HRMS(ESI): C21H21N5OS [M + H]+, 測(cè)量值量值392.1540, 計(jì)算值392.1534.

N-(2-氟苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-14)：白色固體，產(chǎn)率70%, m.p.152-153 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.81 – 9.18(m, 3H), 7.57 (m, 3H), 7.46 – 7.13 (m, 6H), 2.93 – 2.60 (m,4H), 1.90 – 1.61 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ:183.0, 160.0, 149.3, 140.0, 131.7, 128.8, 127.8, 126.9, 124.2,123.5, 119.5, 116.0, 115.7, 23.0, 22.8, 22.7, 20.7.19F NMR(282 MHz, DMSO-d6),δ: ?126.4. HRMS(ESI): C21H20FN5OS[M + H]+, 測(cè)量值432.1265, 計(jì)算值432.1263.

N-(3-氟苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-15)：白色固體，產(chǎn)率72%, m.p.183-184 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 11.26 (s, 1H),9.99 (s, 2H), 7.59 (d,J= 6.9 Hz, 3H), 7.47 – 7.24 (m, 5H),7.00 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 2.83 (t,J= 5.1 Hz, 2H), 2.68 (t,J=5.2 Hz, 2H), 1.89 – 1.61 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSOd6),δ: 181.9, 161.8 (d,JCF= 241.8 Hz), 159.9, 149.3, 141.1 (d,JCF=10.8 Hz), 141.0, 131.8, 130.0 (d,JCF= 8.8 Hz), 128.7, 127.0,123.5, 119.5, 111.27 (d,JCF= 19.7 Hz), 23.0, 22.8, 22.7, 20.7.HRMS(ESI): C21H20FN5OS [M + H]+, 測(cè)量值432.1265, 計(jì)算值432.1268.

N-(4-氟苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺 (I-16)：白色固體，產(chǎn)率76%, m.p.193-194 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.17 (s, 1H),9.85 (s, 2H), 7.59 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.53 – 7.44 (m ,2H),7.43 – 7.28 (m, 3H), 7.26 – 7.16 (m, 2H), 2.82 (t, J = 5.7 Hz,2H), 2.68 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 1.87 – 1.66 (m, 4H).13C NMR(75 MHz, DMSO-d6),δ: 182.2, 159.9, 159.50 (d,JCF= 241.8 Hz), 149.3, 140.1, 135.50(d,JCF=2.4 Hz), 131.8, 128.7, 126.9,126.8, 123.6, 119.5, 115.1 (d,JCF=22.3 Hz), 22.9, 22.8, 22.7,20.7. HRMS(ESI): C21H20FN5OS [M + H]+, 測(cè)量值432.1265,計(jì)算值432.1262.

N-(2-氯苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺 (I-17)：白色固體，產(chǎn)率85%, m.p.187-188 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.31 (s, 1H),9.88 (s, 1H), 9.47 (s, 1H), 7.75 – 7.52 (m, 5H), 7.51 – 7.18 (m,4H), 2.86 – 2.65 (m, 4H), 1.85 – 1.65 (m, 4H).13C NMR(75 MHz, DMSO-d6),δ: 181.9, 162.2, 141.6, 140.3, 139.1,136.7, 129.4, 129.4, 127.8, 127.5, 127.1, 123.4, 119.5, 23.0,22.4, 22.1, 21.3. HRMS(ESI): C21H20ClN5OS [M + H]+, 測(cè)量值448.0969, 計(jì)算值448.0966.

N-(3-氯苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-18)：白色固體，產(chǎn)率89%, m.p.196-197 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.31 (s, 1H),9.89 (s, 1H), 9.47 (s, 1H), 7.74 – 7.39 (m, 7H), 7.38 – 7.12 (m,2H), 2.85 – 2.69 (m, 4H), 1.84 – 1.66 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ: 181.9, 162.2, 141.6, 140.3, 139.1, 136.7,129.4, 129.4, 127.8, 127.4, 127.1, 123.4, 119.5, 23.0, 22.4,22.1, 21.3. HRMS(ESI): C21H20ClN5OS [M + H]+, 測(cè)量值448.0969,計(jì)算值448.0971.

N-(4-氯苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-19)：白色固體，產(chǎn)率83%, m.p.191-192 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.84 – 9.54(m, 3H),7.66 – 7.51 (m, 4H), 7.47 – 7.27 (m, 5H), 2.92 – 2.60(m, 4H), 1.88 – 1.65 (m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ: 181.9, 159.9, 149.3, 140.1, 138.2, 131.8, 128.7, 128.4,127.0, 126.0, 123.6, 119.5, 23.0, 22.8, 22.7, 20.7. HRMS(ESI): C21H20ClN5OS [M + H]+, 測(cè)量值448.0969, 計(jì)算值448.0969.

N-(2-甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-20)：白色固體，產(chǎn)率88%, m.p.175-176 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.20 (s, 1H),9.73 (s, 1H), 9.42 (s, 1H), 7.60 (d,J= 7.0 Hz, 2H), 7.43 – 7.30(m, 3H), 7.30 – 7.13 (m, 4H), 2.83 (t,J= 5.2 Hz, 2H), 2.67 (t,J= 5.5 Hz, 2H), 2.21 (s, 3H), 1.87 – 1.64 (m, 4H).13C NMR(75 MHz, DMSO-d6),δ: 182.5, 160.0, 149.2, 140.1, 137.7,135.6, 131.8, 130.4, 128.7, 126.9, 126.2, 123.6, 119.5, 23.0,22.8, 22.7, 20.7, 17.8. HRMS(ESI): C22H23N5OS [M + H]+, 測(cè)量值406.1696, 計(jì)算值406.1689.

N-(3-甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-21)：白色固體，產(chǎn)率83%, m.p.167-168 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.69 – 9.34(m, 3H), 7.60 (d,J= 7.4 Hz, 2H), 7.46-7.18 (m, 6H), 7.00 (d,J= 7.3 Hz, 1H), 2.82 (t,J= 5.3 Hz, 2H), 2.68 (t,J= 5.5 Hz,2H), 2.32 (s, 3H), 1.87 – 1.63 (m, 4H).13C NMR (75 MHz,DMSO-d6),δ: 181.9, 160.0, 149.3, 140.1, 139.0, 137.8, 131.8,128.7, 128.4, 126.9, 125.7, 124.9, 123.5, 121.6, 119.5, 23.0,22.8, 22.7, 21.2, 20.7. HRMS(ESI): C22H23N5OS [M + H]+, 測(cè)量值406.1696, 計(jì)算值406.1689.

N-(4-甲基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-22)：白色固體，產(chǎn)率85%, m.p.173-174 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.32 (s, 1H),9.75 (s, 2H), 7.60 (d,J= 6.5 Hz, 2H), 7.47 – 7.26 (m, 5H),7.17 (d,J= 7.7 Hz, 2H), 2.82 – 2.58 (m, 4H), 2.31 (s, 3H),1.90 – 1.62(m, 4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ: 181.93,159.95, 149.25, 140.06, 136.55, 134.27, 131.84, 128.97,128.74, 126.92, 124.51, 123.53, 119.47, 22.96, 22.82, 22.71,20.67. HRMS(ESI): C22H23N5OS [M + H]+, 測(cè)量值406.1696, 計(jì)算值406.1689.

N-(2-甲氧基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺 (I-23)：白色固體，產(chǎn)率70%, m.p.151-152 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ10.62 (s, 1H),10.07 (s, 1H), 9.45 – 8.60 (m, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.55 (s, 2H),7.45 – 7.25 (m, 3H), 7.23 – 6.89 (m, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.92 –2.60 (m, 4H), 1.80 – 1.65 (m, 4H).13C NMR (75 MHz,DMSO-d6),δ: 180.0, 160.2, 151.0, 149.4, 139.9, 131.7, 128.9,127.6, 127.0, 125.7, 123.3, 120.0, 119.5, 111.5, 55.9, 22.9,22.8, 22.7, 20.7. HRMS(ESI): C22H23N5O2S [M + H]+, 測(cè)量值444.1465, 計(jì)算值444.1469.

N-(3-甲氧基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺(I-24)：白色固體，產(chǎn)率68%, m.p.183-184 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.36 (s, 1H),9.81 (s, 2H), 7.59 (d,J= 7.4 Hz, 2H), 7.45 – 7.20 (m, 5H), 7.07(d,J= 7.9 Hz, 1H), 6.75 (dd,J= 8.2, 1.9 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H),2.83 (t,J= 5.4 Hz, 2H), 2.68 (t,J= 5.5 Hz, 2H), 1.87 – 1.67 (m,4H).13C NMR (75 MHz, DMSO-d6),δ: 159.9, 159.4, 149.3,140.3, 140.0, 131.8, 129.3, 128.8, 126.9, 123.5, 119.5, 110.4,55.2, 23.0, 22.8, 22.7, 20.7. HRMS(ESI): C22H23N5O2S [M + H]+,測(cè)量值444.1465, 計(jì)算值444.1465.

N-(4-甲氧基苯基)-2-(2-苯基-4,5,6,7-四氫-2H-吲唑-3-羰基)肼-1-硫代甲酰胺 (I-25)：黃色固體，產(chǎn)率71%, m.p.139-140 ℃.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ: 10.30 (s, 1H),9.69 (s, 2H), 7.60 (d,J= 7.6 Hz, 2H), , 7.44 – 7.29 (m, 5H),7.04 – 6.89 (m, 3H), 3.77 (s, 3H), 2.82 (t,J= 5.6 Hz, 2H), 2.68(t,J= 5.6 Hz, 2H), 1.88 – 1.66 (m, 4H).13C NMR (75 MHz,DMSO-d6),δ: 160.0, 158.7, 156.9, 149.3, 140.1, 131.9, 131.8,128.7, 127.5, 126.9, 123.6, 119.5, 115.3, 113.7, 55.4, 23.0,22.8, 22.7, 20.7. HRMS(ESI): C22H23N5O2S [M + H]+, 測(cè)量值444.1465, 計(jì)算值444.1464.

2.2 分子對(duì)接結(jié)果及蛋白結(jié)合活性分析

首先，從理論角度研究目標(biāo)化合物與靶標(biāo)結(jié)合的可能性。采用Molecular Operating Environment(MOE 2018.01) 軟件，選擇EcR 靶標(biāo)蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3IXP)對(duì)所有目標(biāo)化合物進(jìn)行分子對(duì)接?；趯?duì)接打分值 (表1) 推測(cè)，所有化合物與EcR 均具有不同程度的結(jié)合。其中I-7、I-9、I-13 和I-15 的分子對(duì)接打分值與先導(dǎo)化合物C (?8.32)和對(duì)照藥劑蟲酰肼 (?9.01) 的打分值相近，推測(cè)它們與靶標(biāo)蛋白之間可能有較好的結(jié)合力。

表1 目標(biāo)化合物I-01 ～ I-25 的ClogP 值、分子對(duì)接打分值和殺蟲活性Table 1 ClogP, score and insecticidal activities of the target compounds I-01-I-25

其次，為了研究化合物和受體蛋白的結(jié)合模式，隨機(jī)選擇化合物I-15 和蟲酰肼分別對(duì)接到EcR 活性口袋中。結(jié)果 (圖1) 顯示，I-15 酰胺鍵羰基氧原子可以和Tyr408 形成氫鍵，I-15 和蟲酰肼有相似的結(jié)合模式。

圖1 I-15 (藍(lán)色) 和蟲酰肼 (綠色) 在EcR活性位點(diǎn)的結(jié)合模式Fig. 1 Predicted binding modes of compounds I-15 (blue)and tebufenozide (green) in the active site of EcR

進(jìn)一步靶標(biāo)蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2) 表明，在質(zhì)量濃度為40 mg/L 時(shí)，I-15 與EcR 有較好的結(jié)合活性 (75.8%±7.2%) , 但不及蟲酰肼 (93.7%±2.6%) 。

圖2 I-15 和蟲酰肼與PxEcR-PxUSP 的結(jié)合活性Fig. 2 Binding activity of compounds I-15 and tebufenozide against PxEcR-PxUSP

2.3 殺蟲活性

測(cè)定結(jié)果(表1)表明：在500 mg/L 下，部分化合物 (如I-01 和I-23)對(duì)小菜蛾具有一定的殺蟲活性，但活性均不如先導(dǎo)化合物C 及對(duì)照藥劑蟲酰肼。初步構(gòu)效關(guān)系分析可知，取代基的位置對(duì)活性有影響，當(dāng)取代基處于鄰位時(shí)對(duì)活性有利，例如：當(dāng)X 為氧，R 為氯時(shí)，鄰位取代化合物對(duì)小菜蛾的致死率由高到低順序?yàn)椋篒-01 (R=2-Cl) >I-02 (R=3-Cl) > I-03 (R=4-Cl) ，當(dāng)X 為硫，R 為甲氧基時(shí)，鄰位取代化合物對(duì)小菜蛾的致死率由高到低順序?yàn)椋篒-23 (R=2-OCH3) > I-24 (R=3-OCH3) >I-25 (R=4-OCH3) 。此外，鄰位取代基相同時(shí)，X 的類別對(duì)活性也有一定影響。當(dāng)R 為2-Cl 時(shí)，化合物對(duì)小菜蛾的致死率由高到低順序?yàn)椋篒-01(X=O) > I-17 (X=S) ；當(dāng)R 為2-OCH3時(shí)，化合物對(duì)小菜蛾的致死率由高到低順序?yàn)椋?I-23 (X=S) >I-07 (X=O) 。因此，當(dāng)先導(dǎo)化合物C 的苯環(huán)鄰位為吸電子取代基時(shí)，在酰胺橋鏈引入氨基脲可能對(duì)活性有利；當(dāng)先導(dǎo)化合物C 的苯環(huán)鄰位為給電子取代基時(shí)，在酰胺橋鏈引入氨基硫脲可能對(duì)活性有利。

從表1 數(shù)據(jù)可以看出，目標(biāo)化合物的分子對(duì)接打分值與活體殺蟲活性之間無規(guī)律可循，例如，化合物I-15 雖然與EcR 的分子對(duì)接打分值較高，且有較好的蛋白結(jié)合活性，但對(duì)小菜蛾則完全沒有活體活性。進(jìn)一步分析原因發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)化合物的ClogP在2.738 ～ 4.319 之間，普遍低于先導(dǎo)化合物C (ClogP= 6.626) 和對(duì)照藥劑蟲酰肼(ClogP= 4.509) ，新合成化合物的親脂性較弱，不易穿透昆蟲表皮的細(xì)胞膜，這可能是導(dǎo)致殺蟲活性較弱的原因。因此，在下一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化工作中，如何提高化合物的脂溶性是需要重點(diǎn)考慮的因素。

3 結(jié)論

本文以前期發(fā)現(xiàn)的吡唑并環(huán)酰胺類化合物C 為先導(dǎo)，以蛻皮激素受體(EcR)為靶標(biāo)，通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接設(shè)計(jì)并合成了一系列4,5,6,7-四氫-2H-吲唑酰肼類化合物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)過1H NMR、13C NMR 和HRMS 確證。分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)化合物I-15 可以很好地結(jié)合EcR 的活性位點(diǎn)，與蟲酰肼有相似的結(jié)合模式；進(jìn)一步靶標(biāo)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明，化合物I-15 與EcR 具有較高的結(jié)合活性。初步殺蟲活性測(cè)定結(jié)果表明，目標(biāo)化合物對(duì)2 齡小菜蛾有一定的致死率，但總體活性較差。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，化合物的親脂性較低，可能是導(dǎo)致其殺蟲活性較差的原因。本文研究結(jié)果表明，在先導(dǎo)化合物C 橋鏈酰胺上引入氨基脲或氨基硫脲對(duì)殺蟲活性不利，這為后續(xù)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要參考價(jià)值，即如何提高化合物的親脂性是結(jié)構(gòu)優(yōu)化時(shí)需要重點(diǎn)考慮的因素。