杜 康, 陳睿嘉, 李 忠, 邵旭升

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海市化學(xué)生物學(xué)(芳香雜環(huán))重點實驗室，上海 200237)

呋蟲胺 (dinotefuran，以下簡稱為DIN) 是日本三井公司于2002 年上市的第3 代新煙堿類殺蟲劑，與傳統(tǒng)的同類殺蟲劑相比，其效力更高，殺蟲譜更廣，對哺乳動物及鳥類也更為安全[1]?，F(xiàn)今，呋蟲胺已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)蟲害的綜合治理中。不過，呋蟲胺對蜜蜂具有較高毒性。有研究表明，呋蟲胺對蜜蜂幼蟲的化蛹和羽化過程有明顯的抑制作用，對意大利蜜蜂Apis melliferaL.的48h-LD50值為0.033 μg/蜂[2]。此外，呋蟲胺在土壤中具有較高的穩(wěn)定性，半衰期為50～100 d，對土壤存在潛在的污染風險[3]。因此，呋蟲胺必須在合理范圍內(nèi)使用。

目前，農(nóng)藥的不合理施用現(xiàn)象依然嚴重，主要表現(xiàn)為“高劑量、高頻次”的使用，而導(dǎo)致該現(xiàn)象的一大誘因即是傳統(tǒng)方式的農(nóng)藥釋放并不可控[4]。據(jù)報道，以傳統(tǒng)方式施用的農(nóng)藥利用率較低且流失率偏高，并不能精準地抵達目標，而且農(nóng)藥會在揮發(fā)、淋溶和降解中消耗或流入環(huán)境中[5]。為彌補損耗，常常只能以超出臨界值的濃度和頻率施用農(nóng)藥，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)環(huán)境安全造成極大危害[6]。為了解決這一問題，研究者們提出了農(nóng)藥的多種加工方案，如環(huán)糊精包合[7]、納米微球載體[8]、光響應(yīng)膠束[9]等。這些給藥策略在一定程度上控制了農(nóng)藥的釋放速率，但依然無法做到釋放時間和空間的可控。

目前，光控釋放藥物正逐漸成為藥物研究的重要方向。藥物與光敏保護基團 (photolabile protecting group，PPG) 結(jié)合成“籠” (cage) 后，只能在特定波長范圍的光照條件下才會釋放。通過光的調(diào)控，藥物可以在靶標處定時、定量、定位地釋放并發(fā)揮效力[10]。這種給藥策略潔凈、高效，不僅可提高藥物的持效期，減少用藥量，還能降低對非靶標的毒性，并實現(xiàn)藥物監(jiān)測的可視化。近年來，光控釋放技術(shù)在農(nóng)藥領(lǐng)域也得到了較為廣泛的應(yīng)用，如光控釋放的2,4-D[11]、植物生長調(diào)節(jié)劑[12]和性信息素[13]等均已見報道。

本課題組在前期研究中一直致力于香豆素(coumarin) 類PPG 的農(nóng)藥光控釋放研究[14-15]。與其他保護基團 (如硝基芐基和安息香等) 相比，香豆素類PPG 具有穩(wěn)定性好、摩爾吸光系數(shù)高、釋放速率快、釋放波長可調(diào)、結(jié)構(gòu)改造簡單、固有毒性低、生物相容性佳、對生態(tài)環(huán)境較為友好以及骨架與殺蟲活性契合度高等優(yōu)點[16-19]。為了開發(fā)光控釋放的新煙堿類殺蟲劑，本研究將呋蟲胺與作為光敏保護基團的7-二乙基氨基香豆素 (7-diethylamino coumarin，以下簡稱為COU) 相結(jié)合 (圖式1) ，設(shè)計、合成了以COU 為“籠”的呋蟲胺 (coumarincaged dinotefuran，以下簡稱COU-DIN)光控化合物 ，合成路線見圖式2，并研究了所得目標化合物的光物理性質(zhì)、光控釋放行為和殺蟲活性。

圖式 1 目標化合物COU-DIN 的設(shè)計和光控釋放過程Scheme 1 Design and photocontrolled release of our title compound COU-DIN

圖式 2 目標化合物COU-DIN 的合成路線Scheme 2 Synthesis route of the title compound COU-DIN

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MicroMass GCT CA055 質(zhì)譜儀 (ESI 源, Micro Mass, Manchester, England) ；Büchi Melting Point B-540 熔點儀 (Büchi, Flawil, Switzerland) ，溫度未校正；Bruker AM-400 (400 MHz) 核磁共振儀(Bruker, F?llanden, Switzerland) ，以TMS 為內(nèi)標，CDCl3為溶劑；Mettler-Toledo EL204 萬分之一電子天平 (Mettler-Toledo, Zurich, Switzerland) ；Varian Cary Eclipse 熒光分光光度計 (Varian, Palo Alto, America) ；PerkinElmer Lambda 650 紫外-可見分光光度計 (PerkinElmer, Waltham, America) ；Waters Acquity 超高效液相色譜儀 (UPLC, Waters,Milford, America) ；Leica DMI3000B Fluorescent Microscope 熒光顯微鏡 (Leica, Wetzlar, Germany) ；JSZ6 光學(xué)顯微鏡 (江南永信，南京，中國) 。

所用試劑均為市售分析純。

1.2 化合物的合成

目標化合物的合成參考文獻方法[1,14]并稍作調(diào)整。

1.2.1 中間體7-二乙基氨基-4-甲醛基香豆素 (2)的合成 將7-二乙基氨基-4-甲基香豆素 (1，2.6 mmol) 和二氧化硒 (SeO2，3.1 mmol) 依次加入氯苯 (100 mL) 中，回流下攪拌反應(yīng)72 h。薄層色譜(V石油醚:V乙酸乙酯= 5 : 1) 監(jiān)測至反應(yīng)完全。冷卻，過濾，濾液在真空下濃縮，即得化合物2 粗品，黑色油狀物，無需進一步處理直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.2 中間體7-二乙基氨基-4-羥甲基香豆素 (3)的合成 將化合物2 粗品溶于無水四氫呋喃(THF，50 mL) 中，冰浴下加入無水甲醇 (30 mL)和硼氫化鈉 (NaBH4，2.6 mmol) ，攪拌10 min 后恢復(fù)至室溫，再攪拌反應(yīng)5 h。薄層色譜 (V石油醚:V乙酸乙酯= 2 : 1) 監(jiān)測至反應(yīng)完全。反應(yīng)液用稀鹽酸淬滅，10 min 后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余溶劑。加入二氯甲烷 (30 mL) ，分離兩相。有機相用飽和食鹽水 (20 mL) 洗滌兩次，干燥，濃縮，得油狀粗品。該粗品經(jīng)柱層析 (梯度洗脫，V石油醚:V乙酸乙酯=100 : 1～3 : 1) 分離純化，得化合物3，墨綠色粉末，兩步綜合收率30.1% , m.p. 102.8～103.5 °C。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.31 (d,J= 9.0 Hz,1H), 6.55 (dd,J= 9.0, 2.6 Hz, 1H), 6.47 (d,J= 2.6 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 4.85 – 4.82 (m, 2H), 3.39 (q,J= 7.0 Hz, 4H), 2.95 (br., 1H), 1.19 (t,J= 7.0 Hz,6H);13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 162.90, 156.09,155.16, 150.50, 124.40, 108.62, 106.33, 105.28,97.68, 60.87, 44.72, 12.45. ESI-HRMS C14H18NO3[M + H]+計算值：248.1287；測定值：248.1288.

1.2.3 中間體(7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(4-硝基苯基)碳酸酯 (4) 的合成 將對硝基苯基氯甲酸酯 (PNPCl，2.0 mmol) 溶解于無水二氯甲烷 (DCM，15 mL) 中，在氬氣保護及冰浴條件下，緩慢滴加化合物3 (4 mmol) 的DCM 溶液(5 mL) 和二異丙基乙胺 (DIPEA，6.0 mmol) 。室溫下攪拌反應(yīng)24 h。薄層色譜 (V二氯甲烷:V甲醇=100 : 1) 監(jiān)測至反應(yīng)完全后，加入水 (50 mL) 。分離兩相，有機相用飽和食鹽水 (20 mL) 洗滌兩次，干燥，濃縮，得油狀粗品。該粗品經(jīng)柱層析 (梯度洗脫，V二氯甲烷:V甲醇= 100 : 1 ～ 40 : 1) 分離純化，得化合物4，黃色固體，收率40.3%, m.p.121.7 ～ 122.8 °C。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:8.35 – 8.27 (m, 2H), 7.46 – 7.39 (m, 2H), 7.32 (d,J=9.0 Hz, 1H), 6.61 (dd,J= 9.0, 2.6 Hz, 1H), 6.54 (d,J= 2.6 Hz, 1H), 6.23 (s, 1H), 5.43 – 5.40 (m, 2H),3.43 (q,J= 7.0 Hz, 4H), 1.22 (t,J= 7.0 Hz, 6H);13C NMR (100 MHz, CDCl3),δ: 161.64, 156.40,155.23, 152.17, 150.89, 147.72, 145.64, 125.44,124.31, 121.75, 108.82, 106.92, 105.57, 97.93, 65.77,44.82, 12.43. ESI-HRMS C21H20N2O7Na [M + Na]+計算值：435.1168；測定值：435.1166.

1.2.4 目標化合物COU-DIN 的合成 將化合物4(1.0 mmol) 溶解于無水N,N-二甲基甲酰胺 (DMF，8 mL) 中，在氬氣保護、避光及冰浴條件下，向其中緩慢滴加呋蟲胺 (DIN，3.0 mmol) 的DMF(2 mL) 溶液和DIPEA (3.0 mmol) ，避光攪拌反應(yīng)48 h。薄層色譜 (V二氯甲烷:V甲醇= 20 : 1) 監(jiān)測至反應(yīng)完全后，加入DCM (30 mL) 和水 (50 mL)，分離兩相，有機相用飽和食鹽水 (20 mL) 洗滌兩次，干燥，濃縮，得油狀粗品。該粗品經(jīng)柱層析(梯度洗脫，V二氯甲烷:V甲醇= 100 : 1 ～ 25 : 1) 分離純化，得目標化合物 (COU-DIN) ，黃色固體，收率45.1%, m.p. 140.4 ～ 141 °C。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.21 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 6.52 (dd,J= 9.0, 2.5 Hz, 1H), 6.44 (d,J= 2.5 Hz, 1H), 5.98 (s,1H), 5.24 (s, 2H), 3.83 (td,J= 8.4, 5.2 Hz, 1H), 3.73(dd,J= 9.1, 6.8 Hz, 1H), 3.65 (td,J= 8.4, 7.3 Hz,1H), 3.48 (dd,J= 9.1, 4.6 Hz, 1H), 3.35 (q,J=7.1 Hz, 4H), 3.29 (dd,J= 6.9, 5.6 Hz, 2H), 3.22 (s,3H), 2.58 – 2.40 (m, 1H), 2.04 (dtd,J= 13.0, 8.2,5.2 Hz, 1H), 1.53 (dtd,J= 13.0, 7.6, 5.2 Hz, 1H),1.14 (t,J= 7.1 Hz, 6H)；13C NMR (101 MHz,CDCl3),δ: 161.73, 158.87, 156.28, 153.19, 150.80,148.56, 124.48, 109.04, 106.61, 105.76, 97.89, 70.88,67.61, 64.27, 47.23, 44.88, 38.29, 35.75, 29.71, 12.38.ESI-HRMS C22H29N5O7Na [M + Na]+計算值：498.1966；測定值：498.1967.

1.3 光學(xué)性質(zhì)分析

1.3.1 標準曲線的繪制 參考相關(guān)文獻進行標準曲線繪制[14]。以甲醇及水為溶劑 (V甲醇:V水= 1 : 1) ，配制一系列質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 和60 mg/L 的待測化合物 (COU-DIN、DIN和羥甲基香豆素(hydroxymethyl coumarin, 以下簡稱h-COU)) 溶液，經(jīng)UPLC 分析后建立標準曲線。色譜條件：Waters ACQUITY BEH C18色譜柱(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) ；柱溫40 °C；流動相：A 為含三氟乙酸 (φ= 0.01%) 的去離子水溶液，B 為乙腈；流速0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；>1～12 min, 10%～100% B；>12～14 min，100% B。

1.3.2 光控釋放過程的分析 將待測化合物溶于無水甲醇配制成濃度為1 × 10?4mol/L 的母液，以超純水稀釋至5.0 × 10?5mol/L (V甲醇:V水=1 : 1) 。若無特殊說明，測試光源均為1 W、420 nm 的藍光或夏季正午太陽光 (時間：7–8 月，11：00 –12：00；氣溫：(32 ± 1) °C) 。

將上述5.0 × 10?5mol/L 的溶液分為多組，每組一邊攪拌一邊用420 nm 藍光或太陽光照射不同時長，以未光照組為對照。對各組進行UPLC、紫外-可見光吸收光譜 (UV-Vis) 和熒光發(fā)射光譜的分析，以COU-DIN 的峰消失或面積再無明顯變化為測試終點。

根據(jù)標準曲線，計算出各處理組經(jīng)光照處理后化合物的質(zhì)量濃度，建立其自然對數(shù)值與光照時間的曲線，根據(jù)曲線公式得到k值。按公式 (1)計算化合物的光解半衰期 (t1/2) 。

同時，根據(jù)各組光照不同時間后化合物的質(zhì)量濃度，計算出各時間點呋蟲胺的釋放率，測試終點處為總釋放率。

1.4 殺蟲活性測試

試蟲為：苜蓿蚜Aphis craccivora、白紋伊蚊Aedes albopictus和東方黏蟲Mythimna separate，均引進自上海南方農(nóng)藥研究中心。

待測藥液的配制：將稱量好的待測化合物溶于二甲基亞砜 (DMSO) ，用加有曲拉通 (ω= 0.05%)的清水稀釋成所需質(zhì)量濃度。

每個測試均分3 組重復(fù)進行，并設(shè)置空白、DIN 和h-COU 組作為對照。

1.4.1 對苜蓿蚜的殺蟲活性測定 參考文獻方法進行[20]。測試質(zhì)量濃度為5、10、12.5、20、25、40、50、100、150 和200 mg/L 共10 個梯度。A組為經(jīng)420 nm 藍光照射0.5 h；B 組為經(jīng)太陽光照射0.5 h；C 組為不做光照處理黑暗中保存0.5 h。取3～4 cm 蠶豆苗，每苗接入10 只經(jīng)饑餓處理后的苜蓿蚜無翅成蚜。待試蟲于葉片上穩(wěn)定后，將豆苗浸于待測藥液中5 s，陰干。置于 (25±1) °C、黑暗的觀察室內(nèi)培養(yǎng)。48 h 后觀察結(jié)果，蟲體觸之無反應(yīng)即視為死亡。按公式 (2) 計算蟲死亡率(空白對照組的死亡率<5%)，再根據(jù)所得各濃度下的死亡率建立毒力回歸線，并計算出LC50值。

式中：P為死亡率，%；K為死亡蟲數(shù)，頭；N為總試蟲數(shù)，頭。

1.4.2 對白紋伊蚊的殺蟲活性測定 參考文獻方法進行[14,21]。測試質(zhì)量濃度為0.13、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 和64 mg/L 共10 個梯度。每只離心管中接入10 只4 齡白紋伊蚊幼蟲，加入待測藥液，置于 (25±1) °C、黑暗的觀察室內(nèi)培養(yǎng)。24 h 后觀察結(jié)果，蟲體觸之無反應(yīng)即視為死亡。按1.4.1 節(jié)方法計算蟲死亡率和LC50值。

1.4.3 對東方黏蟲的殺蟲活性測定 參考文獻方法進行[20]。測試質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100、200、300、400 和500 mg/L 共10 個梯度。取5～6 cm 玉米葉浸于待測藥液中5 s 后取出，陰干，接入10 只經(jīng)饑餓處理后的東方黏蟲3 齡幼蟲，置于 (25±1) °C、黑暗的觀察室內(nèi)培養(yǎng)。72 h 后觀察結(jié)果，蟲體觸之無反應(yīng)即視為死亡。按1.4.1 節(jié)方法計算蟲死亡率和LC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標化合物的合成

如圖式2 所示，以市售的7-二乙基氨基-4-甲基香豆素 (1) 為原料，經(jīng)4 步反應(yīng)得到目標化合物COU-DIN。首先，化合物1 經(jīng)“氧化-還原”得到4-羥甲基香豆素 (3) 。其中，對氧化過程，宜選用新鮮的SeO2；在進行還原反應(yīng)時，須在冰浴下緩慢加入NaBH4，否則易發(fā)生副反應(yīng)。之后再經(jīng)兩步反應(yīng)，通過PNPCl 使化合物3 以氨基甲酸酯橋與呋蟲胺偶聯(lián)，即得目標產(chǎn)物COU-DIN。通過對不同的堿加以篩選，最終確定在DIPEA 條件下，兩步反應(yīng)的綜合產(chǎn)率均可達40%。

2.2 COU-DIN 的光學(xué)性質(zhì)

2.2.1 光物理學(xué)性質(zhì) 首先，采用紫外-可見分光光度計對目標化合物COU-DIN 進行全波段掃描(200～700 nm) ，以尋找合適的光控釋放波段。結(jié)果 (表1 和圖1) 表明，COU-DIN 在275 和396 nm處有兩個良好的紫外吸收峰，分別對應(yīng)呋蟲胺與香豆素部分，其中396 nm 為COU-DIN 的最大吸收波長，屬近可見紫光區(qū)，且摩爾吸光系數(shù) (ε)

圖1 COU-DIN (A)和呋蟲胺(B)的紫外吸收光譜Fig. 1 UV-Vis for COU-DIN (A) and dinotefuran (B)

表1 COU-DIN 和呋蟲胺紫外-可見光譜數(shù)據(jù)Table 1 UV-Vis data for COU-DIN and dinotefuran

為1.62 ×104L·mol?1·cm?1。這說明COU-DIN 對光具有較高的靈敏度，可以利用396 nm 左右的光進行照射，以促進其釋放呋蟲胺。同時，此波長處于可見光區(qū)，對生物體較為安全[11,18,22-23]，預(yù)示COU-DIN 可能具有較好的實際應(yīng)用價值。

2.2.2 光控釋放性能 鑒于420 nm 的藍光可以被COU-DIN 很好地吸收，且其對生物體的危害也比396 nm 的紫外光更小[11,18,22-23]，同時為了直接模擬實際的田間給藥過程，本研究分別選擇可見光范圍內(nèi)的藍光 (1 W、420 nm，A 組) 和太陽光 (B 組)進行COU-DIN 的光控釋放性能研究。

圖2 展示了在UPLC 監(jiān)測下COU-DIN 的光控釋放過程。COU-DIN 的保留時間t= 5.6 min，該處峰面積隨光照時間的延長而逐漸減少，說明420 nm 藍光和太陽光均能調(diào)控COU-DIN 的裂解，且在太陽光照下的裂解速度更快；而在t=1.8 min 和t= 4.5 min 處，保留時間分別與作為對照DIN 和h-COU 的一致，且兩處峰面積均隨光照時間的延長而增加，說明DIN 和h-COU 是COUDIN 的光控釋放產(chǎn)物。根據(jù)已報道的光控釋放反應(yīng)機理[11,13,18]，推測t=5.89 min 的峰是4-甲氧基甲基香豆素。

圖2 COU-DIN 在420 nm 藍光 (A) 和太陽光 (B) 下的光控釋放過程Fig. 2 Photocontrolled release of COU-DIN under 420 nm blue light (A) and sunlight (B)

同時以紫外-可見光吸收光譜和熒光發(fā)射光譜監(jiān)測了420 nm 光照下COU-DIN 的光控釋放過程。該過程中，長波紫外區(qū)域的最大吸收波長會出現(xiàn)藍移，短波區(qū)的吸光度會不斷增加 (圖3-A) ；而熒光強度則隨光照時間的增加而增強，并發(fā)生藍移 (圖3-B) 。這些現(xiàn)象均表明，光控釋放產(chǎn)物h-COU 和DIN 會隨光照時長的增加而增多，并趨于穩(wěn)定。

圖3 COU-DIN 的紫外-可見光吸收光譜(A)及熒光發(fā)射光譜(B)隨光照時間的變化Fig. 3 Changes of UV-Vis (A) and fluorescence spectra(B) for COU-DIN with irradiation

進一步測定了COU-DIN 在420 nm 藍光照射下的光控釋放曲線。如圖4 所示，得到了直線方程：y= ?0.0835x+ 0.2243，R2 = 0.9873?？梢?，COU-DIN 可以穩(wěn)定高效地光控釋放，其過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)，反應(yīng)速率常數(shù)k= 0.0835 min?1，光分解半衰期t1/2= 8.30 min。

圖4 COU-DIN 的光控釋放曲線Fig. 4 Photocontrolled release curve of COU-DIN

將COU-DIN 在室溫、黑暗狀態(tài)及V(水) :V(甲醇) = 1 : 1 的溶液中保存14 d，分解率< 10%，證明該化合物對水具有較好的穩(wěn)定性，光控釋放過程不受其他因素影響。

圖5 表明了不同420 nm 光照模式下的COUDIN 光控釋放過程。當光一直照射時，呋蟲胺的釋放量會隨著光照時間的延長而增多，直至最終達到飽和 (圖5-A) ；而采用“開-關(guān)”間歇式光照時，呋蟲胺的釋放量也會呈階梯式上升 (圖5-B) 。兩種光控釋放模式下，呋蟲胺的總釋放量均約90%。這說明COU-DIN 的田間實用價值較好，可以通過控制光照條件以定時定量地精準釋放出呋蟲胺。

圖5 不同光控模式下的呋蟲胺釋放率Fig. 5 Release rate of dinotefuran under different light modes

2.3 COU-DIN 的殺蟲活性

測定了光照前后COU-DIN 對苜蓿蚜、白紋伊蚊及東方黏蟲的LC50值。結(jié)果 (表2) 表明： h-COU對各靶標試蟲的LC50值均遠高于COU-DIN 或呋蟲胺；光照組與未光照組兩種條件相比，COU-DIN的殺蟲活性存在明顯差異。同時，COU-DIN 組的試蟲中毒癥狀與呋蟲胺的中毒癥狀相同 (試蟲抽搐后麻痹、停止進食，最終死亡) 。這說明所測得的COU-DIN 組的殺蟲活性均來自于原化合物本身或釋放出的呋蟲胺。對所有靶標試蟲，COU-DIN 經(jīng)太陽光照后的LC50值均大于藍光照射后的值，其原因如前所述，太陽光能比單波長的藍光能更好地激發(fā)COU-DIN 中的呋蟲胺進行光釋放。但在兩種光照條件下，COU-DIN 對所有靶標試蟲的LC50值均大于呋蟲胺本身，這是因為COU-DIN在兩種光照條件下的釋放率僅90%，還有待進一步提高?？傮w而言，COU-DIN 可以有效地受光調(diào)控釋放出呋蟲胺并發(fā)揮殺蟲作用。

表2 COU-DIN 對3 種靶標的殺蟲活性Table 2 Insecticidal activities of COU-DIN against 3 targets

3 結(jié)論

將香豆素類光敏保護基團與呋蟲胺相連接，設(shè)計合成了目標化合物COU-DIN，首次實現(xiàn)了新煙堿類殺蟲劑呋蟲胺的光控釋放。COU-DIN 可由420 nm 藍光或太陽光照控制釋放出呋蟲胺并發(fā)揮殺蟲效力。該化合物在水中穩(wěn)定性好，40 min 即可受釋放完全，釋放效率高達90%，對苜蓿蚜、白紋伊蚊、東方黏蟲的殺蟲活性與呋蟲胺相當，具有田間實用的潛力。進一步的研究正在本課題組中開展。