葉 倩，朱富偉，萬 凱，黃聰靈，唐雪妹

（1廣東省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與監(jiān)測技術研究所，廣州 510640；2廣東省農產品質量安全風險評估重點實驗室，廣州 510640；3農業(yè)農村部農產品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

復合蔬果汁飲品，旨在提供多種維生素、礦物質的同時兼具有豐富的口感而備受青睞。但由于復合蔬果汁原料為多種新鮮蔬菜水果，而蔬菜水果在種植過程中不可避免的施用農藥，同時盲目或過量地使用這些農藥而造成的環(huán)境污染、農藥超標等問題使得蔬果汁中農藥殘留存在一定的隱患。吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、啶 蟲 脒 (acetamiprid)、噠 螨 靈(pyridaben)作為廣譜類的殺菌劑、殺蟲劑以及殺螨劑，目前在農業(yè)生產中廣泛應用，在初級農產品中也有一定的檢出率。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過抑制線粒體呼吸作用，使細胞缺乏正常代謝所需能量，最終導致細胞死亡[1]。啶蟲脒作為煙堿類殺蟲劑，主要作用于昆蟲神經結合部后膜,通過與乙酰膽堿受體結合使昆蟲興奮-痙攣-麻痹-死亡，同時對抗有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的害蟲有特效[2]。噠螨靈作為一種噠嗪酮類殺螨劑，因其對食植性害螨具有明顯的防治效果而被廣泛應用。目前中國對吡唑醚菌酯、啶蟲脒、噠螨靈在飲料類中只規(guī)定了茶葉、茉莉花、咖啡豆、啤酒花中的限量，而蔬果汁中并無相應的限量規(guī)定[3]。因此，建立快速、靈敏的檢測方法，對監(jiān)測復合蔬果汁中農藥的殘留具有一定的重要意義。

目前，吡唑醚菌酯和噠螨靈主要通過氣相色譜(GC)[4-7]、液相色譜(LC)[8-11]、氣相色譜-質譜聯用(GCMS)[12-13]、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)[14-16]等檢測方法進行。啶蟲脒報道的比較多的檢測方法主要集中于液相色譜法(LC)[11,17]和液相色譜-串聯質譜法(LCMS/MS)[16,18]。由于氣相色譜法、液相色譜法的靈敏度較低，易受干擾，準確度較低，在基質相對簡單的作物上的單個殺菌劑殘留分析中發(fā)揮著重要作用。質譜法的選擇性和靈敏度相對較高，在果蔬、谷物、茶葉、中藥材、飲料、肉類等復雜基質的多殘留分析中發(fā)揮著主要作用。復合蔬果汁基質相對于一般的植物源、動物源基質酸性較大，含水量較高。本研究采用SPE凈化技術與LC-MS/MS結合，建立了一種快速、靈敏地檢測復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶蟲脒和噠螨靈殘留的定量分析方法。

1 實驗步驟

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU 8050液相色譜-串聯質譜儀（日本島津公司）；漩渦振蕩器(德國海道爾夫公司)；離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；超純水儀（美國密理博公司）；電子天平(梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司)；氮吹儀（美國Organomation公司）。

色譜級乙腈、二氯甲烷、甲醇（德國默克公司）；色譜級甲酸（美國西格瑪公司）；SPE-NH2固相萃取柱（美國安捷倫公司）；分析純乙酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（廣州化學試劑廠）。尼龍濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、噠螨靈(pyridaben)和啶蟲脒(acetamiprid)標準品濃度為1000mg/L(純度≥99.0%)，購置于農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

復合蔬果汁購于本地超市。分別以番茄，芒果和橙子作為基底液的3種復合蔬果汁，在外觀顏色上分別呈現紅色、黃色、橙色。

1.2 樣品的提取以及凈化

提?。悍Q取10.00 g樣品，用20m L酸化乙腈溶液（含體積分數1%乙酸），渦旋振蕩5m in進行提取，后加入4.00 g無水硫酸鎂、2.00 g無水乙酸鈉，再次渦旋振蕩2 m in；以4500 r/m in離心5 m in[19]，取上清液10 m L于另一干凈離心管中，氮吹至凈干，使用2m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液復溶，等待下一步凈化。

凈化：首先采用4m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液對所使用的SPE-NH2凈化柱進行活化，當溶劑液面達到凈化柱吸附層表面時，且溶劑未完全流凈時，加入提取待凈化溶液，用4m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液洗滌離心管后，再次對SPE-NH2凈化柱進行洗脫，重復2次，收集洗脫液，用氮氣吹收集到的洗脫液至近干，用乙腈定容到5m L，使用尼龍濾膜過濾后，等待儀器測定。

1.3 LC-MS/MS條件

色譜柱：島津Shim-pack XB-18色譜柱(2.1mm×50mm,2.6μm)。液相色譜及串聯質譜儀器條件[19-20]見表1；吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的質譜檢測參數見表2。

表1 LC-MS/MS條件

表2 吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的質譜檢測參數

1.4 標準溶液配制及標準曲線的繪制

將吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒標準溶液，用適宜溶劑配制成儲備液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ捎?種目標物在所用儀器的靈敏度不同，因此分別使用經測定不含目標化合物的復合蔬果汁基質溶液將吡唑醚菌酯和噠螨靈配制為 0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列標準溶液；將啶蟲脒配制為0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.0 mg/L系列標準溶液，以1.3節(jié)所述儀器條件進行檢測，以各待測目標化合物的定量離子響應值為縱坐標(y)，以對應的質量濃度為橫坐標(x)得到各目標化合物的標準曲線[21]，以便得到3種待測物的線性方程以及相關系數(R2)。

1.5 正確度和精密度

稱取經測定不含吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的復合蔬果汁樣品10.00 g，使用標準溶液儲備液進行0.010、0.10和0.50mg/kg 3個濃度的添加[21]，每個添加濃度重復6次。渦旋混勻后，按照1.2節(jié)所述條件進行樣品前處理。計算各添加濃度平均回收率及相對標準偏差(RSD)，用以考察方法的正確度和精密度。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑優(yōu)化

介于3種復合蔬果汁組成上的差別，致使不同復合蔬果汁在組成成份以及pH值存在一定的差異。試驗采用乙腈和酸化乙腈進行了提取溶劑優(yōu)化。結果如圖1所示：使用乙腈提取時，吡唑醚菌酯的回收率為88.5%～118.6%，RSD為3.6%～16.0%；噠螨靈的回收率為97.4%～111.6%，RSD為4.5%～15.7%；啶蟲脒的回收率處于73.1%～125.6%之間，RSD為7.3%～13.4%；使用含1%(v%)乙酸的乙腈溶液提取時3種農藥的回收率在87.5%～106.8%之間，RSD為1.3%～9.5%，回收率以及相對標準偏差均優(yōu)于使用乙腈的提取效果。分析其原因，可能是由于提取液中所含有的乙酸與后續(xù)提取中所加入的無水乙酸鈉形成了一個緩沖體系，穩(wěn)定了提取體系的同時對目標物的提取也產生了一定的促進作用，確切原因需要進一步的研究考證。

圖1 不同提取溶劑對不同復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈、啶蟲脒的提取效果影響

2.2 SPE柱洗脫液的優(yōu)化

基于3種復合蔬果汁成分以及pH上的差異，試驗對比了采用氨基SPE柱進行樣品凈化時，分別使用二氯甲烷-甲醇和乙腈-甲苯作為洗脫液時對3種農藥回收率的影響。結果如圖2所示：使用二氯甲烷-甲醇為洗脫液時3種被試物的回收率為87.5%～106.8%，RSD為1.3%～9.5%；采用乙腈-甲苯為洗脫液時3種被試物的回收率為67.8%～119.9%，RSD為0.6%～14.5%。相比之下二氯甲烷-甲醇為洗脫液時3種被試物的回收率及RSD相對穩(wěn)定。本研究中最終使用二氯甲烷-甲醇為洗脫液，氨基SPE柱進行樣品凈化。

圖2 不同洗脫溶劑對不同復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈、啶蟲脒的洗脫效果影響

2.3 線性方程、檢出限和定量限

使用1.4節(jié)所述方法配制吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒系列梯度基質匹配標準溶液，得到3種目標化合物的線性方程。結果表明（表3）：吡唑醚菌酯和噠螨靈在0.001～0.50mg/L、啶蟲脒在0.005～1.0mg/L范圍內，3種目標化合物線性關系良好，相關系數(R2)在0.9984以上。定量限(LOQ)為最低添加濃度0.010mg/kg。

2.4 正確度和精密度

用復合蔬果汁空白基質分別添加0.01、0.10、0.50mg/kg 3個濃度的上述3種農藥，以測定方法的正確度和精密度。按照1.2節(jié)方法進行前處理，1.3節(jié)方法進行測定，試驗結果表明（表3）：添加0.010、0.10、0.50mg/kg 3個濃度時，3種目標農藥的平均回收率、相對標準偏差(RSD)分別介于80.6%～113.4%、0.5%～9.3%之間，可以滿足復合蔬果汁中目標農藥的定性、定量分析要求[22]。

2.5 基質效應

為了提高目標化合物的測定準確度，需要對不同基質產生的基質效應作出評價，并選擇合適的方法減小基質效應的影響。本研究采用基質效應=（基質匹配標準溶液響應-純溶劑標準溶液響應）/純溶劑標準溶液響應×100[23]的方式對試驗中所產生的基質效應進行了評價。在0.10mg/L時，3種農藥在3種復合蔬果汁中的基質效應，結果見表3：吡唑醚菌酯在3種復合蔬果汁中都表現出基質增強效應，且3種蔬果汁中的差異相對較大，其中橙汁為基底液的復合蔬果汁中表現最強，達到56.8%。噠螨靈在3種復合蔬果汁中既有增強效應也有減弱效應，番茄、芒果為基底液的復合蔬果汁中表現出較弱的基質減弱效應-2.1%～-4.0%；而橙汁為基底液的復合蔬果汁中則表現出基質增強效應24.2%。啶蟲脒在3種復合蔬果汁中既有增強效應也有減弱效應，番茄、芒果為基底液的復合蔬果汁中表現出較強的基質減弱效應-56.0%～-54.0%；而橙汁為基底液的復合蔬果汁中則表現出基質增強效應14.2%。分析發(fā)現，3種農藥在橙汁為基底液的復合蔬果汁中均表現出基質增強效應。在番茄、芒果為基底液的復合蔬果汁中則有所不同，分析是否與基質的成分以及酸堿度(pH)有關，或者其他可能的原因需進一步研究分析確證。因此為保證定量結果的準確性，本論文中采用基質匹配標準溶液對數據進行校準，進而消除基質效應對檢測結果的影響。

表3 復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留測定方法確認(n＝6)

3 討論與結論

本研究建立了LC-MS/MS同時測定復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留的方法。目前文獻中對這3種目標物的殘留測定主要集中于蔬菜、水果等初級農產品以及土壤中，對于加工后農產品的報道相對較少。因此，本方法建立的在酸性較強且含水量較高的基質中同時測定吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒3種不同種類農藥殘留的方法在一定程度上彌補了這個空缺。同時，本研究中的目標物是目前農業(yè)生產中常用的3種殺菌劑、殺螨劑、殺蟲劑，對后續(xù)相似基質中同類目標物的殘留分析提供一定參考數據。

本研究中的基質酸性較強且含水量較高，對于一些酸不穩(wěn)定的殘留物來說，在酸性條件下是否會產生代謝產物，這些代謝產物是否也同樣會對人體健康產生一定的潛在危害，是否需要一并測定，需進一步進行研究討論。因此，使用該方法時可以根據目標物在酸性環(huán)境是否會產生代謝物進行考慮，必要時可對相關代謝物也一并進行測定。本研究是否適用于在酸性條件下不穩(wěn)定易降解的目標物，本文并沒有進一步進行研究，這也需進一步進行驗證。同時，基于風險評估的角度，單個農產品的攝入，對人體健康產生的風險，與同時攝入多種農產品產生的風險也存在差異。同時攝入多種農產品產生的風險，可能會產生疊加效應，因此需進一步進行探討。

本研究通過優(yōu)化樣品提取和凈化方法，建立了LC-MS/MS同時測定復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留的方法。本方法提供了在酸性較強且含水量較高的基質中同時測定吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒3種不同種類農藥殘留的方法，采用基質匹配標準溶液對數據進行校準，從而有效降低了檢測過程中串聯質譜所產生的基質效應對檢測結果準確度的影響。樣品前處理相對簡便、檢測靈敏度高，方法的線性關系在0.9984以上、在添加濃度為0.010、0.10和0.50 mg/kg時，3種目標物的回收率為80.6%～113.4%；相對標準偏差(RSD)介于0.5%～9.3%之間，正確度和精密度等指標均可滿足農藥殘留檢測的要求[22]，該方法適用于復合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒等同類農藥殘留的同時檢測分析。