耿妍 史海濤 耿燕

非酒精性脂肪性肝?。╪on?alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年增加，已成為全球第一大慢性肝病，且是終末期肝病的主要原因［1?2］。最重要的是，非酒精性脂肪性肝炎（non?al?coholic steatohepatitis，NASH）中多達20%的患者可能發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌（hepatocellular carci?noma，HCC）［3］。因此，對NAFLD 患者進行準(zhǔn)確的診斷并對其進行早期預(yù)防和治療具有重要的意義。近年來國外研究表明，細(xì)胞角蛋白18?M30 片段（cytokeratin?18 M30 fragment，CK18?M30）可用于作為預(yù)測NAFLD 的新的血清學(xué)指標(biāo)，特別是用于區(qū)分NASH 和NAFLD［4］。此外，NAFLD 確切的發(fā)病機制仍不十分明確，普遍認(rèn)為其與糖脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗、炎癥、氧化應(yīng)激及腸道菌群等有關(guān)。目前尚沒有基于確實證據(jù)的獲批藥物用于NAFLD 的治療。由此可見，揭示NAFLD 的發(fā)病機制，尋找更有效的治療靶點及藥物是脂肪肝研究領(lǐng)域的熱點及難點。本研究通過高脂膳食建立大鼠NAFLD 模型，以探討CK18?M30 與NAFLD 的相關(guān)性，旨在為NAFLD 發(fā)現(xiàn)新的、無創(chuàng)性的血清學(xué)診斷指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)，并分析腸源性內(nèi)毒素與NAFLD 的相關(guān)性，探討腸道菌群在NAFLD 的作用，以期為NAFLD 的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 雄性大鼠［動物合格證號：skxk（shaan）2018?001］購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。糞便總DNA 提取試劑盒購自北京艾德萊試劑有限公司（DN2301）。實時定量PCR 反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa 公司（RR430A）。ELISA 試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司（IL18/F15950，ck18/F5922）。內(nèi)毒素endotoxin，ET）檢測試劑盒（北京金山川科技發(fā)展有限公司，批號：EC200310）

1.2 實驗動物與分組

8 周齡雄性SD 大鼠26 只（SPF 級），平均體重160 g 左右，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。分籠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心（動物實驗條件符合二級標(biāo)準(zhǔn)）。高脂飼料配方：10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%豬膽鹽、82.5%基礎(chǔ)飼料；普通飼料購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

26 只大鼠隨機分為3 組，NC 組（n=6）：普通飲食；NAFLD 組（n=12）：高脂飲食喂養(yǎng)8 周；NASH組（n=8）：高脂飲食喂養(yǎng)12 周。各組動物于喂養(yǎng)周數(shù)結(jié)束時采用10%水合氯醛3.5 ml/kg 麻醉處死大鼠，留取肝臟、末端回腸組織、血、糞便標(biāo)本。NAFLD 及NASH 組在喂養(yǎng)結(jié)束時先處死一只大鼠采用肝臟組織HE 染色確保模型建立成功。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清生化指標(biāo)檢測

全自動生化分析儀（貝克曼全自動生化分析儀AU5800/5811）檢測血清：膽固醇（Total choles?terol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（As?partate Aminotransferase，AST）。光度法測定血清ET。采用ELISA 法檢測血清IL?18、CK18?M30。

1.3.2 肝臟組織及回腸粘膜HE 染色

分別取各組大鼠肝臟及回腸組織，置于4%的多聚甲醛溶液中，常規(guī)制成石蠟切片，行HE 染色。在光學(xué)顯微鏡下依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院NASH 臨床網(wǎng)病理工作組指南［5］，及《2010年非酒精性脂肪肝病診療指南》［6］內(nèi)容對肝組織切片在病理學(xué)和形態(tài)學(xué)上進行評價。

1.3.3 腸道糞便中乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬的測定

嚴(yán)格按照北京艾德萊試劑糞便總DNA 提取試劑盒及日本TaKaRa 公司熒光實時PCR 反應(yīng)試劑盒操作。以DNA 為模板，PCR 擴增大腸桿菌屬，乳酸桿菌屬，雙歧桿菌屬，標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件包進行數(shù)據(jù)分析；計數(shù)資料采用（±s），多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LDL?t 檢驗；采用Pearson 相關(guān)分析和Spearman 秩相關(guān)分析自變量和因變量之間的相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及飲食變化

實驗過程中，各組大鼠均無死亡。NC 組大鼠皮毛光澤，活動多，反應(yīng)靈敏。NAFLD 及NASH組大鼠皮毛暗淡無光澤，活動減少，反應(yīng)降低。

2.2 肝臟病理變化

NC 組可見肝細(xì)胞呈條索狀排列。NAFLD 組肝細(xì)胞排列整齊，可見散在小泡性脂滴浸潤，無明顯炎癥細(xì)胞及壞死。NASH 組可見肝細(xì)胞排列明顯紊亂，存在大量脂肪空泡，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理改變（HE，×400）Figure 1 Pathological changes of liver of rats in each group（HE，×400）

2.3 腸道病理改變

NC 組可見小腸粘膜表面微絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰。NAFLD 組小腸粘膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞游離面微絨毛短小，可見少許炎性細(xì)胞浸潤，伴灶性糜爛；NASH 組小腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞游離面微絨毛排列紊亂甚至消失，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 各組大鼠小腸粘膜病理改變（HE，×400）Figure 2 Pathological changes of small intestinal mucosa of rats in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠血清指標(biāo)的比較

NAFLD 組、NASH 組ET、CK18?M30 高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；NASH 組ET、CK18?M30 高于NAFLD 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；NASH 組ALT、AST、IL?18高于NC組及NAFLD 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NAFLD 組與NC 組間相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、IL?18 及CK18（M30）的比較（±s）Table 1 Comparison of serum transaminase、endotoxin、IL18 and CK18（M30）of rats in each group（±s）

表1 各組血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、IL?18 及CK18（M30）的比較（±s）Table 1 Comparison of serum transaminase、endotoxin、IL18 and CK18（M30）of rats in each group（±s）

注：與NC 組比較，aP<0.05；與NAFLD 組比較，bP<0.05。

分組NC 組NAFLD 組NASH 組F 值P 值n6 1 2 8 ALT（IU/L）47.69±10.39 50.58±12.63 92.62±15.42ab 1.231 0.005 AST（IU/L）140.67±13.27 156.75±13.19 215.13±29.74ab 1.512 0.013 ET（pg/mL）4.28±1.65 15.43±4.64a 42.31±8.01ab 20.361 0.001 IL?18（ng/L）85.23±8.61 88.61±9.63 120.38±13.76ab 1.651 0.017 CK18?M30（IU/L）113.33±15.19 125.75±12.51a 143.87±14.66ab 1.348 0.003

2.5 各組大鼠肝臟脂肪變性及炎癥活動度

NASH 及NAFLD 組大鼠肝脂肪變性程度及非酒精性脂肪肝活動度積分（NAFLD activity score，NAS）均高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NASH 組脂肪變性程度及NAS 高于NAFLD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組肝臟脂肪變性程度及NAS 相比較（±s）Table 2 Comparison of hepatic steatosis degree and NAS of rats in each group（±s）

表2 各組肝臟脂肪變性程度及NAS 相比較（±s）Table 2 Comparison of hepatic steatosis degree and NAS of rats in each group（±s）

注：與NC 組比較，aP<0.05；與NAFLD 組比較，bP<0.05。

分組NC 組NAFLD 組NASH 組F 值P 值脂肪變性程度6 12 8 06 0 0 10 8 0 20 3 3 30 1 5 NAS 0.40±0.54 1.58±0.67a 4.67±0.71ab 1.381 0.003

2.6 各組大鼠腸道菌群的比較

NAFLD 組、NASH 組大腸桿菌屬計數(shù)均高于NC 組，而雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬計數(shù)低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NASH 組大腸桿菌屬計數(shù)高于NAFLD 組，而雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬計數(shù)低于NAFLD 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬計數(shù)的比較（±s）Table 3 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

表3 各組大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬計數(shù)的比較（±s）Table 3 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

注：與NC 組比較，aP<0.05；與NAFLD 組比較，bP<0.05。

分組NC 組NAFLD NASH 組F 值P 值n 6 1 2 8大腸桿菌（mmol/L）8.41±0.96 9.54±0.69a 10.27±0.75ab 13.352 0.000雙歧桿菌屬（mmol/L）9.23±0.65 8.36±0.57a 6.53±0.69ab 15.618 0.001乳酸桿菌屬（mmol/L）8.38±0.72 7.33±0.49a 5.69±0.58ab 14.837 0.001

2.7 大鼠血清ET 與腸道菌群、轉(zhuǎn)氨酶、IL?18、NAS 的相關(guān)性分析

pearson 相關(guān)分析及spearman 秩相關(guān)分析表明，ET 與大腸桿菌屬、IL?18、ALT、AST、NAS 均呈正相關(guān)（P<0.05），與乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見表4。

表4 ET 與腸道菌群、IL?18、ALT、AST、NAS 的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of intestinal flora with endotoxin and liver fat chang

2.8 大鼠血清CK18?M30 與ALT、AST、IL?18、NAS 的相關(guān)性分析

pearson 相關(guān)分析及spearman 秩相關(guān)分析表明，CK18?M30 與ALT、AST、IL?18、NAS 均呈正相關(guān)（P<0.05）。見表5。

表5 CK18?M30 與ALT、AST、IL?18、NAS 的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of CK18?M30 with ALT、AST、IL?18 and NAS

3 討論

非酒精性脂肪肝的發(fā)病率逐年升高，其發(fā)展到NASH、肝硬化甚至肝癌時，嚴(yán)重危害人民健康。因此對NAFLD 早期診斷具有重要意義。目前，多個血清生物標(biāo)記物如TNF?α、IL?6、IL?10，miRNA［7］等在NAFLD 患者體內(nèi)呈現(xiàn)不同程度的改變。其中細(xì)胞因子CK18?M30 是肝內(nèi)主要的中間絲蛋白，是各種肝臟疾病細(xì)胞凋亡過程中形態(tài)學(xué)變化的特征［8］。已有研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 患者體內(nèi)CK18?M30 的水平均顯著升高，CK18?M30 水平是NASH 的獨立預(yù)測指標(biāo)［9］。這與本研究是一致的，本研究在此基礎(chǔ)上通過行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CK18?M30與炎癥因子、轉(zhuǎn)氨酶及NAS 均呈正相關(guān)，推斷CK18?M30 可成為預(yù)測NAFLD 的血清學(xué)指標(biāo)。

目前，對于NAFLD 的發(fā)病機制仍不明確，近年來，腸道菌群作為“微生物器官”對人體健康的影響受到廣泛關(guān)注。高美麗等［10］研究證實，通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)可改善患者肝功能及血清炎癥指標(biāo)。目前研究已證實腸道菌群失調(diào)在NAFLD 的發(fā)病及進展中起著重要的作用。腸道菌群過度生長導(dǎo)致腸黏膜屏障功能破壞，使得內(nèi)毒素移位至肝臟，進而激活庫普弗細(xì)胞與其特異性受體CD14和TLR4 相結(jié)合，通過激活下游的NF?ΚB 等信號通路釋放一系列氧自由基和炎癥因子造成肝臟微環(huán)境變化，繼而誘發(fā)或加劇肝臟發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激損傷［11?13］。因此腸道微生態(tài)、腸道屏障、內(nèi)毒素及與NAFLD 之間是相互關(guān)聯(lián)的。

現(xiàn)有研究表明腸道菌群失調(diào)與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NAFLD 患者腸道菌群結(jié)構(gòu)同正常人群相比存在顯著差異，表現(xiàn)為有益菌的減少，有害菌的增加［14?15］，腸道菌群過度生長可破壞腸黏膜屏障功能，使得內(nèi)毒素移位至肝臟，繼而誘發(fā)或加劇肝臟發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致肝臟脂肪變性、炎癥及纖維化的發(fā)生及進展。本實驗通過高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD 及NASH 模型，檢測各組血清中ET 水平，同時與轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子、NAS、腸道菌群行相關(guān)性分析，明確內(nèi)毒素在NAFLD 進展為NASH 中的發(fā)揮重要作用，與之前研究是一致的，而內(nèi)毒素進入血循環(huán)是以哪種吸收途徑進行的，仍需要進一步研究證實。

綜上所述，CK18?M30 有助于NAFLD 的早期診斷及預(yù)測NASH 的發(fā)生，NAFLD 的發(fā)病機制較復(fù)雜，目前仍無理想的治療藥物，設(shè)想可采用調(diào)整腸道微生態(tài)的藥物來減輕肝損傷，并有助于延緩NAFLD 的發(fā)生發(fā)展。