楊昱萍，李 珍，劉建青

（包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014030）

牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是單分子負(fù)鏈RNA病毒目（Mononegavirales）的成員，主要侵害牛的呼吸道，臨床可見(jiàn)咳嗽、呼吸急迫、流淚、流鼻液及流涎等癥狀（Mathieu等，2007）。BRSV還可導(dǎo)致牛的白血球減少癥，乳牛泌乳量顯著減少，甚至停止，懷孕母牛發(fā)生流產(chǎn)等，給養(yǎng)牛業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失（馮軍科等，2010）。因此，快速檢測(cè)牛場(chǎng)BRSV具有重要意義。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)BRSV的成熟方法有好幾種，主要有免疫學(xué)檢測(cè)、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)法、電子顯微鏡觀察病毒粒子及RT-PCR檢測(cè)法（Ulrike等，2002）。由于BRSV接種到細(xì)胞上大約5 d才會(huì)出現(xiàn)病變，多數(shù)情況下病變并不明顯，且不易觀察，嚴(yán)重影響該方法的檢出率。此外，盡管電子顯微鏡觀察病毒粒子用時(shí)較短，但敏感性不高。相反，RT-PCR是一種高效、敏感、穩(wěn)定的檢測(cè)方法，是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)BRSV最常用的方法（Juan等，2001）。提取病毒核酸，利用Primer5.0設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物是該方法的關(guān)鍵。本研究旨在建立一種RT-PCR方法，能快速、有效地檢測(cè)BRSV，為防治BRSV提供相應(yīng)幫助。

1 材料與方法

1.1 毒株及對(duì)照細(xì)胞 牛呼吸道合胞體病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒3型、口蹄疫病毒、MDBK細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

將BRSV接種到長(zhǎng)成單層MDBK細(xì)胞上，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生明顯病變時(shí)收獲病毒液，-70℃保存?zhèn)溆茫≒hilip等，2006）。

1.2 常規(guī)試劑與RT-PCR試劑 購(gòu)自北京化工有限公司和大連寶生物公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的BRSV各毒株的全序列，選擇保守性較強(qiáng)的N基因，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，由Invitrogen（北京）公司合成。引物序列如下：

上游引物：

下游引物：

1.4 病毒RNA的提取 按照Trizol Reagent 試劑的說(shuō)明提取BRSV總RNA（Prozzi等，1997）。

主要步驟如下：

（1）吸取樣品250 μL，加入Trizol Reagent裂解液750 μL，顛倒混勻，室溫放置5 min。

（2）加 入200 μL氯 仿，混 勻，室 溫 放 置5 min。

（3）4℃，12000 r/min離心10 min。

（4）取600 μL水層液體至新的、DEPC處理過(guò)的1.5mL離心管中，然后加入600 ul異丙醇，室溫靜置30 min。

（5）4℃，12000 r/min離心10 min。

（6）倒掉上清，用1000 μL 75% DEPC冰乙醇洗滌。

（7）12000 r/min，4℃，離心10 min。

（8）倒掉乙醇，置于通風(fēng)櫥中干燥20 min。

（9）加入20～30 μL DEPC水溶解。

（10）-80℃保存。

1.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 吸取4 μL RNA提取液于離心管中，加入2 μL Random Primers、5 μL DEPC水、4 μL 5×Buffer、3 μL 10mmol/L dNTPs、1 μL Rnasin（40U/μL）、1 μL AMV，總 體 積20μL。42℃水浴1 h（Valarcher等，1999）。

1.6 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 在反應(yīng)體系中依次加入2μL cDNA、16 μL超 純 水、2.5 μL 10×Buffer、上游下游引物各1 μL、2 μL dNTPs、0.5 μL E Taq，總體積是25 μL。PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s，47℃ 30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10 min。

1.7 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 RT-PCR特異性與敏感性檢測(cè) 取BRSV細(xì)胞培養(yǎng)物、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒3型病毒、口蹄疫病毒、MDBK正常細(xì)胞培養(yǎng)物，分別提取RNA進(jìn)行RTPCR，進(jìn)行電泳。將BRSV的細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA并且定量，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行RT-PCR，電泳，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.9 臨床應(yīng)用 采集38份臨床癥狀類(lèi)似BRSV引起流鼻液的鼻拭子樣品，應(yīng)用上述方法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BRSV在MDBK細(xì)胞上產(chǎn)生病變 由圖1a，圖1b可知，將BRSV接種于MDBK細(xì)胞，5 d后細(xì)胞變圓、變大，聚集成團(tuán)，產(chǎn)生明顯病變。

圖1a BRSV在MDBK細(xì)胞上的病變圖

圖1b 正常MDBK細(xì)胞

2.2 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 由圖2可知，本方法擴(kuò)增出特異性目的條帶的大小為287 bp。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 RT-PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果 由圖3可知，將BRSV細(xì)胞培養(yǎng)物、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒3型病毒、口蹄疫病毒、MDBK正常細(xì)胞培養(yǎng)物分別提取RNA進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果只有BRSV的細(xì)胞培養(yǎng)物能擴(kuò)增出目的條帶，其他對(duì)照組均沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶。

圖3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果 由圖4可知，對(duì)不同濃度的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本方法能檢測(cè)出1 pg的病毒RNA。

圖4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 RT-PCR檢測(cè)鼻拭子樣品的結(jié)果 對(duì)采集的38份臨床癥狀類(lèi)似BRSV引起流鼻液的鼻拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有10份樣品出現(xiàn)了287 bp的目的條帶。

3 討論

（1）本試驗(yàn)的技術(shù)關(guān)鍵是BRSV核酸提取質(zhì)量，在試驗(yàn)過(guò)程中要有一個(gè)清靜的環(huán)境，盡可能降低Rnase對(duì)病毒RNA的降解（高存福等，2007）。在PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)退火溫度做了梯度試驗(yàn)，在46～49℃之間均能擴(kuò)增出目的條帶，其中47℃時(shí)效果最好。

（2）根據(jù)已發(fā)表的BRSV序列，在其N(xiāo)基因上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離的BRSV進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，證明該檢測(cè)方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)牛呼吸道合胞體病毒病作出診斷。

（3）PCR的敏感性試驗(yàn)證明該方法可以檢測(cè)到1pg的病毒RNA，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果非常接近，說(shuō)明該RT-PCR檢測(cè)方法具有很高的敏感性。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到相同的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明該試驗(yàn)方法具有很強(qiáng)的操作性，為臨床上快速診斷牛呼吸道合胞體病毒提供了一個(gè)可靠的方法。

（4）本實(shí)驗(yàn)建立的RT-PCR方法可以直接從牛鼻拭子樣品中檢測(cè)出BRSV。從內(nèi)蒙某牛場(chǎng)采集了38份疑似病例樣品，應(yīng)用此方法檢測(cè)出10份樣品為陽(yáng)性，表明BRSV存在于規(guī)?；?chǎng)中，為該病預(yù)防提供了幫助，有助于降低由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。