張秀霞，張澤龍，李軍濤，魯耀鵬，鄭佩華，冼健安*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南 海口 571101)

弧菌屬于細(xì)菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria)、弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌屬(Vibrio)[1-2]?；【剖腔【恐形ㄒ坏目?，包括以弧菌屬為代表的8個屬，共計(jì)159個種，主要分布在海洋與河口環(huán)境中，在淡水中偶爾也有分布，某些種類是水產(chǎn)動物與人類重要的病原菌，具有潛在的環(huán)境效應(yīng)[3]。致病性弧菌如哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌等，是導(dǎo)致水產(chǎn)動物病害暴發(fā)的重要原因[4-6]；人們食用了遭弧菌污染的水產(chǎn)動物，會引發(fā)腹瀉、腹痛、嘔吐等食物中毒癥狀[7]；傷口感染了創(chuàng)傷弧菌，會引發(fā)組織潰爛，導(dǎo)致組織壞死，甚至危及生命安全[8]。在一次我國13個地區(qū)2 980份生食動物性水產(chǎn)品樣本調(diào)查中，副溶血性弧菌檢出率達(dá)到14.7%，創(chuàng)傷弧菌檢出率為3.5%[9]，可見弧菌對人類的危害性不容忽視。

16S rDNA基因序列長約1.5 kb，具有高度的保守性和特異性，常被用于原核微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方面的研究[10]。16S rDNA作為原核生物分類的重要分子標(biāo)記，在細(xì)菌鑒定相關(guān)工作中起到重要作用[11-13]。熱休克蛋白60(HSP60)基因作為HSPs家族中最為保守的亞類，廣泛存在于真核生物及原核生物中，發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14]。促旋酶(Gyrase)的B亞單位(gyrB)普遍存在于細(xì)菌核酸中，該基因呈單拷貝，比16S rDNA的進(jìn)化速度快，而且包含可變區(qū)和保守區(qū)，符合用于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育靶基因的要求，有利于細(xì)菌鑒定及快速檢測[15-16]。本研究從西沙永樂群島海域的海水中分離弧菌菌株，并用多個基因引物進(jìn)行序列擴(kuò)增與比對分析，確定一種可靠的海洋弧菌分子鑒定方法，同時對西沙永樂群島海域海洋弧菌的多樣性進(jìn)行初步調(diào)查與評價，旨在為相關(guān)方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海水樣品取自中國南海西沙永樂群島7個島礁(晉卿島、石嶼、銀嶼、全富島、鴨公島、甘泉島、羚羊礁筐仔沙洲)近岸水域，每個島礁設(shè)兩個位點(diǎn)，每個取樣位點(diǎn)的海水樣品取15 L，用0.22 μL微孔濾膜進(jìn)行抽濾，濾膜放于離心管中，置于-20℃冰箱中保存并帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與純化

配制TCBS瓊脂培養(yǎng)基，于121℃滅菌20 min，冷卻至50℃后倒入一次性培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基厚度約6 mm。取出微孔濾膜，浸泡于15 mLPBS緩沖液中，進(jìn)行超聲波振蕩10 min，取100 μL涂布于TCBS平板上，然后置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；另取100 μL接種到已滅菌的TCBS液體培養(yǎng)基中，置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取100 μL涂布于TCBS平板上，再置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取不同形態(tài)特征的單菌落至TCBS平板中，利用劃線分離法進(jìn)一步純化，置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線分離純化2次，獲得純種菌株。

1.2.2 菌株的鑒定

1)形態(tài)學(xué)及顯微鏡觀察

觀察菌落狀態(tài)，挑選純種菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察形態(tài)特征。

2)16S rDNA基因擴(kuò)增及檢測

挑取純化的單菌落至20 μL無菌水中作為擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：2×F8 FastLong PCR MasterMIX 12.5 μL，引物16S-F和16S-R各1 μL，模板1 μL，無菌超純水9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性10 s，55℃退火15 s；72℃延伸15 s，34個循環(huán)，72℃溫育5 min。PCR產(chǎn)物用含Goldview的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，電壓110 V，時間30 min。選取大小約1 500 bp的PCR產(chǎn)物送樣至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測序，將測序得到的菌株16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，若有相似度高的序列信息則進(jìn)行下載，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3)HSP60基因擴(kuò)增及檢測

挑取純化的單菌落至20 μL無菌水中作為擴(kuò)增模板。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×F8 FastLong PCR MasterMIX 12.5 μL，引物HSP60-F和HSP60-R各1 μL，模板1 μL，無菌超純水9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸10 s，30個循環(huán)；72℃ 溫育5 min。PCR產(chǎn)物用含Goldview的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，電壓90 V，時間30 min。選取大小約600 bp的PCR產(chǎn)物送樣至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測序，將測序得到的菌株HSP60序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，若有相似度高的序列信息則進(jìn)行下載，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

4)gyrB基因擴(kuò)增及檢測

設(shè)計(jì)3對gyrB引物，見表1。挑取純化的單菌落至20 μL無菌水中作為擴(kuò)增模板，PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×F8 FastLong PCR MasterMIX 12.5 μL，正向引物和反向引物各1 μL，模板1 μL，無菌超純水9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸10 s，34個循環(huán)；72℃溫育5 min。PCR產(chǎn)物用含Goldview的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，電壓110 V，時間30 min。選取大小約1 200 bp的PCR產(chǎn)物送樣至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的菌株gyrB序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，若有相似度高的序列信息則進(jìn)行下載，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

2 結(jié)果

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)分析

根據(jù)不同的菌落形態(tài)對菌株進(jìn)行挑選，共挑選出菌株47株，其中晉卿島10株、石嶼5株、銀嶼5株、全富島6株、鴨公島9株、甘泉島7株、筐仔沙洲5株。47株菌株全為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下形態(tài)為短小的桿狀、彎曲的弧狀或者S形(表2)。

表2 菌株的菌落形態(tài)及顏色Tab.2 Colony morphology and colours of strains

續(xù)表2

2.2 菌株的分子鑒定

2.2.1 16S rDNA鑒定

利用16S rDNA引物，47株菌株均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，部分菌株擴(kuò)增條帶見圖1。比對結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)菌株與多個不同弧菌菌種模式菌株的序列相似性同時高于99%，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時大部分實(shí)驗(yàn)菌株都不能與模式菌株聚為一個分支(圖2)，因此利用16S rDNA基因不能成功鑒定弧菌到種。

2.2.2 HSP60鑒定

利用HSP60引物，47株菌株均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，部分菌株擴(kuò)增條帶見圖3。47株菌株的比對結(jié)果均顯示，與實(shí)驗(yàn)菌株相似度高于90%的菌株只有Vibrioneocaledonicus和Vibrioalginolyticus，無法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，因此利用HSP60基因不能成功鑒定弧菌到種。

2.2.3gyrB鑒定

分別利用gyrB1引物和gyrB2引物，均只有6株菌株能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，利用gyrB3引物，47株菌株均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，部分菌株擴(kuò)增條帶見圖4。gyrB3擴(kuò)增序列比對結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)菌株序列與多個模式菌株序列相似度大于98%，能成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。

通過gyrB3序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，47株菌株分屬于7個種：Vibrioalginolyticus、Vibrioharveyi、Vibriomediterranei、Vibrioowensii、Vibriocoralliilyticus、Vibriofortis、Vibriovariabilis。

2.3 不同島礁海域的弧菌多樣性分析

經(jīng)gyrB3序列的分子鑒定，鴨公島海域分離鑒定到5種弧菌，弧菌多樣性最高；甘泉島海域次之，分離鑒定到4種弧菌；石嶼和羚羊礁筐仔沙洲的弧菌多樣性最低，均只分離鑒定到2種弧菌。溶藻弧菌在7個島礁海域中均被分離到，強(qiáng)壯弧菌只在銀嶼海域中被分離到(表3)。

表3 不同島礁海域的弧菌多樣性Tab.3 Diversity of Vibrio in sea area of different islands

3 討論

弧菌是水生動物常見的致病菌[18-19]，人類食用了弧菌超標(biāo)的海鮮或者傷口被弧菌感染，均會對人類的健康帶來嚴(yán)重的危害，甚至危及生命[7-8]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，富營養(yǎng)化嚴(yán)重的養(yǎng)殖水體往往容易暴發(fā)弧菌疾病，因此檢測水域中弧菌的種類、多樣性和豐度可以在一定程度上為水域環(huán)境狀況評價提供參考依據(jù)。

細(xì)菌種類鑒定是微生物領(lǐng)域的重要工作，近年來分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為微生物種類鑒定提供了技術(shù)支撐，分子生物學(xué)技術(shù)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性可以很好地彌補(bǔ)生理生化鑒定的不足。16S rDNA序列分析法是細(xì)菌鑒定的基礎(chǔ)方法之一，然而由于16S rDNA的高度保守性，使得16S rDNA序列在一些不同種細(xì)菌間的相似性非常高，甚至擁有完全一樣的堿基序列[20]。Ohara C M等[21]和Erler R等[22]的研究表明16S rDNA序列不能區(qū)分弧菌屬中的副溶血性弧菌和溶藻弧菌。本研究也發(fā)現(xiàn)，弧菌16S rDNA序列的種間相似度非常高，實(shí)驗(yàn)菌株與多個不同種模式菌株序列相似性同時高于99%，導(dǎo)致采用16S rDNA序列無法鑒定到種。

HSP60基因是高度保守的管家蛋白-分子伴侶蛋白編碼基因，相比16S rDNA基因，HSP60的進(jìn)化速度相對更快，因而更適用于作為近源關(guān)系細(xì)菌間鑒定的分子標(biāo)記[23]。在本研究中也設(shè)計(jì)了一對HSP60引物，47株弧菌均能擴(kuò)增出目標(biāo)片段，但由于在GenBank中各類弧菌的HSP60基因信息量仍較少，相似度高于90%的弧菌僅有2種，因此目前仍無法利用HSP60基因準(zhǔn)確鑒定弧菌到種。

gyrB為促旋酶的B亞單位基因，該基因進(jìn)化速率快，每100萬年的平均堿基替換率為0.7%～0.8%[24]，屬于信息通路中DNA復(fù)制、限制、修飾或修復(fù)有關(guān)的蛋白編碼基因，存在于大多數(shù)細(xì)菌中，并且不顯現(xiàn)頻繁的水平轉(zhuǎn)移，具備了作為系統(tǒng)發(fā)育分析靶基因的條件。由于gyrB作為蛋白編碼基因，其所固有遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，因此gyrB基因在細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，特別是在近緣種的菌株的區(qū)分及鑒定方面受到高度關(guān)注[25]。gyrB基因既彌補(bǔ)了16S rDNA的高保守性，也克服了16S-23S rDNA序列高變異性和復(fù)雜性。Venkateswaran K等[26]研究發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌與溶藻弧菌的16S rDNA序列的相似率為99.7%，而1 258 bp的gyrB序列的相似率僅為86.8%，可以明顯區(qū)分出這兩種弧菌。Vuddhakul V等[27]通過對霍氏弧菌(V.hollisae)部分gyrB序列分析顯示，該序列與副溶血弧菌的相似率為80%，可明顯區(qū)分該兩種弧菌。本研究選用16S rDNA、HSP60、gyrB作為靶基因?qū)Y選的47株弧菌進(jìn)行擴(kuò)增及測序，通過與GenBank中相似性較高的弧菌進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16S rDNA和HSP60均不能成功鑒定弧菌到種，引物gyrB3能成功擴(kuò)增所有47株菌株，且成功構(gòu)建47株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，表明利用gyrB3引物進(jìn)行海洋弧菌的分子鑒定是可靠有效的方法。

通過gyrB3的分子鑒定，在永樂群島7個島礁海域分離的47株弧菌分屬于7個種，其中溶藻弧菌的存在具有普遍性，在7個島礁海域中均有存在；而強(qiáng)壯弧菌僅在銀嶼海域中被分離到。在7個島礁中，鴨公島海域的弧菌多樣性程度最高，甘泉島、銀嶼、全富島、晉卿島次之，銀嶼和羚羊礁筐仔沙洲最低。近年來，永樂群島的鴨公島、銀嶼和全富島開放了觀光旅游，其中鴨公島上還提供了游客的餐飲服務(wù)，餐飲垃圾與污水的排放可能是鴨公島海域弧菌多樣性較為豐富的主要原因之一?？傮w而言，永樂群島7個島礁近海海域的弧菌多樣性較低。