沈嘉森，蘇永昌，林河通，李水根，陳曉婷，劉智禹*

(1.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；3.福建水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術研發(fā)中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；4.福建海洋職業(yè)技術學校，福建 福州350002)

高血壓是以動脈收縮壓或舒張壓增高為特征的慢性病，同時是引起多種并發(fā)癥的心血管疾病[1]。目前，常見的沙坦類、普利類等降血壓藥都有良好的降壓效果，但易引起血膽固醇、甘油三酯升高，提高糖脂代謝異常等糖尿病的發(fā)病機率，引發(fā)蛋白尿等腎衰竭癥狀，更嚴重者還會導致心率過緩、誘發(fā)急性心力衰竭[2]。而天然提取的降血壓抑制肽生物活性多[3-4]、經(jīng)濟價值高、易消化吸收、安全性高等[5]特點受到廣泛關注。圍繞食源性血管緊張素轉化酶(Angiotensin-I converting enzyme，ACE)抑制肽開發(fā)高效的降血壓活性產(chǎn)品具有很高的研究價值。但絕大多數(shù)抑制肽只在活性上做研究，未能對制備工藝、分離純化體系作出總結[6]。因此，本文歸納ACE抑制肽的發(fā)展及維持血壓平衡作用的關系，從ACE抑制肽的工藝制備、分離純化鑒定、構效關系、體內外活性評價研究方面展開論述，以期為深入研究ACE抑制肽奠定基礎。

1 ACE抑制肽概況

ACE屬二肽外肽酶，是含鋅元素的羧基肽酶。作為機體腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)中的調節(jié)劑，廣泛分布于肺、睪丸等組織臟器中[7-8]。在平衡血壓方面，血漿中的ACE酶將無活性的十肽血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)的羧基端水解成有活性的八肽血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)和二肽的組氨酰亮氨酸(His-Leu)，從而促進血管收縮、血壓升高。除了誘導血管緊張素Ⅱ收縮外，它還作用于激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS) 抑制緩激肽(Bradykinin，BK)分解成無活性片段，也會使血壓增高[9]。

血管緊張素轉化酶抑制肽(Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEⅠ)是通過抑制Ang Ⅱ的合成或減少緩激肽的釋放，從而為降低血壓提供有效途徑[10]。ACE抑制肽在平衡血壓中起到?jīng)Q定性作用。Oshima G等[11]最早是在明膠食物中進行細菌膠原酶降解時獲得的ACE抑制肽，通過分析其氨基酸組成和SephadexG-25證實了其6條ACE抑制活性較強序列主要集中在分子量較小的部分；Wang J P等[8]研究的牡蠣純化ACE抑制肽VVYPWTQRF(Val-Val- Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe)對小鼠有降壓活性。因此，研究ACE抑制肽對高血壓患者治療有積極作用和廣闊前景[12]。

2 ACE抑制肽的制備

ACE抑制肽以食源性蛋白為原料，包括馬鈴薯[13]、葵花籽[14]、昆蟲[15]、牡蠣[16]、禽類[17]等動植物，通過酸堿提取法、微生物發(fā)酵法、虛擬水解法及酶解法等制備方法[18]進行提取。

2.1 酸堿提取法

酸堿提取法是指利用適量的酸或堿與蛋白源生物體反應，通過調節(jié)pH使蛋白成分溶解析出的一種提取方式，但成本較高、提取效率極低。范彥娜等[19]通過堿溶酸沉的方式直接從枸杞提取ACE抑制肽，多肽粗蛋白提取含量僅占34.15%，ACE活性約為71.15%。楊敏[20]以鰈(Paralichthysolivaceus)魚皮為原料，通過加入磷酸浸泡提取膠原蛋白，結果表明磷酸可提取出典型的Ⅰ型膠原蛋白，提取得率達41.1%。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法利用微生物代謝發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶將原料中的蛋白質酶解成小分子生物活性肽，該法成本低，可獲得較好的ACE抑制活性，但操作繁瑣[21]。姚雨杉[22]利用納豆芽胞桿菌發(fā)酵魷魚加工副產(chǎn)物，通過響應面分析得到最佳工藝參數(shù)：在發(fā)酵時間37.5 h、發(fā)酵溫度42.1℃、接種量6.0%、料液比22.7的條件下制備樣品，測得其ACE抑制率為82.22%。高潔等[23]采用納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊，通過單因素和響應面方法的結合，在發(fā)酵時間38.4 h、發(fā)酵溫度39.9℃、接種量6.0%、料液比22.5的工藝下得到的ACE抑制率為83.70%。

2.3 虛擬水解法

虛擬水解是利用已知蛋白序列，借助計算機的特定酶解技術進行酶切，將水解得到的特定小肽進行數(shù)據(jù)庫篩選比對[24]，找到高活性的多肽，此法可直接獲得特定的多肽序列，且抑制活性較好，但模擬篩選的方式較傳統(tǒng)酶解方法仍有較多不確定的因素。紀慧卓等[25]基于生物信息學的方式，以大黃魚為蛋白源虛擬酶解出CMK、GWR、 WAK 和 WQK，其IC50分別為 0.19、2.40、0.40、1.10 mmol/L。于志鵬等[26]虛擬酶解雞蛋蛋白，通過生物活性、分子質量、水溶性、吸收代謝等性質預測出與ACE能穩(wěn)定結合的FQK、WGK、ADW，其IC50分別為(250±0.25)、(222.74±1.02)、(85.38±0.54)μmol/L。

2.4 酶解法

酶解法是由于蛋白酶具有不同的特異性酶切位點，將蛋白質分子酶切成多個小片段的氨基酸序列，從而獲得具有降血壓功效的ACE抑制肽等天然產(chǎn)物，是目前制備活性肽最常用的方法，具有專一性和高效性等特點[27-28]。Lee J K等[29]利用6種蛋白酶在適宜水解條件下酶解鮭(Oncorhynchusketa)魚皮，結果顯示胰蛋白酶的IC50為1.08 mg/mL，表現(xiàn)出最高的ACE抑制活性。Khiari Z等[30]在胃蛋白酶酶解24 h條件下，研究獲得的魚皮副產(chǎn)物多肽的ACE抑制活性為74.1%，具有抗氧化、降血壓等多種生物活性。

3 ACE抑制肽的分離純化

食源性的蛋白通過多種提取方式加工制備混合多肽，但其酶解液成分復雜，要研究多肽的生物活性還需進一步分離純化[31]。目前，多肽的提取制備主要基于膜分離、凝膠層析和離子交換層析等技術及反向高效液相色譜法進行逐級分離純化[32]。

3.1 膜分離技術

膜分離技術(Membrane separation technique，MST)是多肽的混合物根據(jù)不同分子量的孔徑大小，通過陶瓷膜和超濾膜等，實現(xiàn)選擇性分離的技術，可達到分離提純的目的[33]，其在常溫下有效成分損失少、操作方便、濃縮成本低。目前，根據(jù)孔徑的截留量劃分為微濾(Microfiltration，MF)、超濾(Ultrafiltration，UF)、納濾(Nanofiltration，NF)等。本文介紹的超濾技術是利用膜的兩側能量差作為推動力，通過超濾膜表面的微孔結構，截留分子量范圍在1～300 kDa的蛋白質、多肽等分子。Cao D等[34]通過超濾得到>10 kDa、3～10 kDa和<3 kDa三個組分，提取<3 kDa的龍須菜胰蛋白酶多肽液具有(78.15±1.56)%的ACE抑制活性。宋華曾等[35]超濾魚回(Ictaluruspunctatus)魚皮明膠提取液，得到>3 kDa和<3 kDa兩組分多肽，體外活性評價表明<3 kDa的抑制活性優(yōu)于>3 kDa，并進一步在小鼠體內獲得了驗證。綜上研究表明，小分子量多肽的生物活性優(yōu)于大分子量多肽[36]。

3.2 凝膠層析技術

凝膠層析技術(Gel filtration chromatography，GFC)也稱分子篩/排阻色譜，基于不同分離物的蛋白分子量大小差異，根據(jù)凝膠篩分子量大的先出峰的洗脫原理獲取活性高的目標物質[37]，其操作條件溫和、不需要有機溶劑、能分離出高分子物質，但對于分子量接近的蛋白質分離效果較差。Lin Y H等[38]利用Sephadex G-15凝膠柱將PN-1蛋白洗脫出7個組分，其F組分顯示最高的IC50，為0.015 mg/mL。Zhang T等[39]通過Sephadex G25、Superdex 10/300 GL純化獲得的牡蠣蛋白G1E1的IC50為0.045 mg/mL。

3.3 離子交換層析

離子交換層析(Ion-exchange chromatography，IEC)利用蛋白質分子所帶電荷的不同這一特性，在一定pH濃度下與離子交換劑進行分離洗脫，從而達到分離提純的目的[37]，但遇到特殊的蛋白結構則難分離。Liu P R等[16]通過固定化金屬離子交換純化了兩種新穎的ACE抑制肽His-Leu-His-Thr(HLHT)和Gly-Trp-Ala(GWA)，IC50值分別為(458.06±3.24) μmol/L和(109.25±1.45) μmol/L。Wu S G等[40]利用IEC離子交換層析從魚肉蛋白水解產(chǎn)物中純化出新型ACE抑制肽Arg-Val-Cys-Leu-Pro(RVCLP)，對其進行體外ACE抑制活性研究，測得IC50值為175 μmol/L。

3.4 反向高效液相色譜

反向高效液相色譜法(Reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)以非極性的反相介質為固定相、極性有機溶劑或其水溶液作為流動相進行溶質的洗脫分離，利用極性較強或親水的樣品分子與反相柱中的固定相結合作用較弱而使溶質較快流出，普遍適用于分離極性、非極性或離子型化合物，具有良好的選擇性。Ji W等[41]通過多步純化得到的超濾水解產(chǎn)物(AKH)在IEC和RP-HPLC技術分離下，得到六肽Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro，其IC50為(0.93±0.05) mg/mL。

4 ACE抑制肽的鑒定和分子模擬

分離純化后的多肽，通過對其多肽序列進行鑒定，從而篩選出有ACE抑制作用的氨基酸序列；利用降血壓數(shù)據(jù)庫與序列進行比對，將分子模擬技術進一步運用，找到與ACE具有高效相互作用的序列，通過計算機篩選、固相合成出序列，以進行下一步的體外活性實驗。

4.1 氨基酸序列的鑒定

氨基酸序列的鑒定方法包括質譜、核磁共振、紅外/紫外光譜等技術[42]。其中，質譜(Mass spectrometry，MS)是諸多鑒定蛋白質和多肽序列結構較為廣泛的方法，利用樣品去離子化后，以離子的質荷比不同而實現(xiàn)分離，再根據(jù)離子譜峰的強度差異而達到分析的目的[43-44]。Abdel-Hamid M等[45]利用高效液相色譜-串聯(lián)質譜對水牛乳肽進行鑒定，分析質譜結果得到QPPQ、IPPK、FPGPIPK和IVPN等4種新型ACE抑制肽。Kim H J等[46]通過多種純化技術，結合電噴霧電離串聯(lián)質譜儀，鑒定分析得到發(fā)酵魚醬中的4種ACE抑制肽，分別為 PK、GCK、NHP和DGGP。

4.2 多肽分子模擬

分子模擬是利用計算機以原子水平的分子模型為基礎，模擬出分子體系的物理、化學特性，應用于多肽包括分子對接、分子動力學和構效分析等[47]方面的研究。

4.2.1 分子對接

ACE分子對接運用分子模擬軟件，主要研究ACE與ACE抑制劑分子間的相互作用，并預測其結合模式和結構功能關系[30，48]。Shi L等[49]對ACE抑制肽NTLTLIDTGIGMTK進行分子對接，得出ACE抑制肽NTLTLIDTGIGMTK可能對ACE的殘基Glu123、Glu403、Arg522、Glu376、Gln281和Asn285有抑制作用。Jalkute C B等[50]研究睪丸截短型ACE(tACE)與賴諾普利抑制劑的分子模擬，結果表明tACE的殘基Ala 354、Glu 376、Asp 377、Glu 384、His 513、Tyr 520和Tyr 523通過氫鍵相互作用穩(wěn)定作用于賴諾普利。王曉丹[51]將YS和INNQFLPYPY通過范德華力和靜電力與ACE發(fā)生結合，INNQFLPYPY與ACE中部的氨基酸殘基His365、Lys522和 His524發(fā)生氫鍵相互作用。

4.2.2 分子動力學

ACE抑制肽分子動力學反應是基于多肽與酶發(fā)生催化作用，研究酶濃度與抑制肽的反應速率。一般分為不可逆抑制和可逆抑制，可逆抑制進一步細分為競爭性、非競爭性和反競爭性抑制[52]。Zhang B Y等[53]通過分離純化蛋清多肽，分析ACE抑制肽LAPYK的分子動力學特性，結果顯示LAPYK為競爭抑制劑。Zarei M等[54]在棕櫚仁蛋糕分離純化的三條ACE抑制肽，分別為YLLLK、WAFS和GVQEGAGHYALL，應用ACE抑制肽分子動力學反應分析3條抑制肽均為混合型抑制劑。

4.2.3 構效分析

定量構效關系(Quantitative structure-activity relationship，QSAR)利用計算機數(shù)理統(tǒng)計模型來研究抑制肽的生物活性與分子結構的效應關系以及抑制肽在生物體內吸收、分布、代謝、排泄等生理性質。Shu M等[48]利用偏最小二乘法對58個二肽、55個三肽和50個四肽進行定量結構-活性關系模型表征，QASR的相關系數(shù)(r2)分別為0.902、0.985和0.872，交叉驗證(q2)分別為0.860、0.951和0.770，結果得出ACE抑制肽序列的疏水性和空間特性在生物活性上起著重要作用。雖然ACE的構效分析并不完善，但ACE抑制肽的活性可能受其氨基酸含量影響，大部分研究也表明含疏水性的羧基端是導致ACE抑制活性的關鍵[55]。Qi C Y等[56]基于3D-QSAR與分子對接研究含有疏水性殘基苯丙氨酸C末端的ACE抑制肽的生物活性，構建了CoMFA(q2= 0.773，r2= 0.992)和CoMSIA(q2= 0.664，r2= 0.990)模型，固相擬合了4種ACE抑制三肽GEF、VEF、VRF和VKF，通過體外活性得出IC50值分別為13、23、5和11 mmol/L，與預測值基本吻合。

5 ACE抑制肽在體內及體外活性評價

檢驗分離純化的ACE抑制肽是否具有生物活性，一方面是在體外研究多肽的ACE抑制率及穩(wěn)定性；另一方面通過構建原發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR) )模型，在體內進行口服灌胃、尾部靜脈等實驗，以血壓值、血清和肺組織中的ACE活性和Ang II含量為指標，探究ACE抑制肽作用機制。

5.1 大鼠體內活性評價

ACE抑制肽體內活性研究多以SHR的血壓值為指標，研究其降壓活性[57]。Girgih A T等[58]將鮭魚蛋白SPH進行RP-HPLC分離，得到SF1～SF4組分，將30 mg/kg SF3組分經(jīng)大鼠口服給藥2 h后，結果表明其能降低大鼠血壓值(42.1 ± 3.4) mmHg。Lee J K等[29]分離純化出3個ACE抑制合成肽(Gly-Leu-Pro、Asn-Leu-Pro、Gly-Leu-Pro)，其中Gly-Leu-Pro在體內活性和體外功能評價中均表現(xiàn)出降血壓的生理功能。張可佳等[59]等將牡蠣ACE抑制肽灌胃大鼠的28 d實驗中，第21 天 ACE抑制肽的降壓效果顯著優(yōu)于灌胃同等質量的生理鹽水，且具有良好的消化穩(wěn)定性。García-Tejedor A等[60]在牛乳鐵蛋白中提取ACE抑制肽，通過口服灌胃10 mg/kg多肽(DPYKLRP、PYKLRP、YKLRP、KLRP、LRP和GILRP)進行SHR血壓試驗，并在藥理水平上研究ACE活性和Ang Ⅱ含量，結果顯示DPYKLRP、PYKLRP、YKLRP和LRP均可有效降低血壓20～30 mmHg，灌胃DPYKLRP和LRP的ACE活性、Ang Ⅱ含量均降低。

5.2 體外功能活性評價

體外研究檢測相對于體內實驗操作簡單、可靠性強，研究方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色譜法等[61]。根據(jù)反應體系，ACE抑制劑與ACE酶的活性位點相結合，阻斷了Ang II 與失活片段的生成，以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)為Ang I的模擬物，HHL被ACE分解后生成馬尿酸(Hippuric acid，HA)和二肽(His-Leu，HL)，通過測定HA的含量分析ACE抑制肽的體外降壓活性。Cushuman D W等[61]利用紫外分光光度法，以HHL作為底物添加ACE和ACE抑制肽，通過在λ=228 nm下測定HHL的吸光值來檢測ACE抑制肽的活性。Wu J等[33]利用RP-HPLC分離技術，在C18柱上將抑制肽和HHL的反應物通過三氟乙酸、乙腈和水的混合液進行梯度洗脫，定量地分析HHL和HA的峰面積。Wang Y T等[47]通過胃蛋白酶模擬體外消化系統(tǒng)實驗，分析5個ACE抑制肽的胃腸道穩(wěn)定性，其中3個二肽Gln-Trp、Cys-Tyr和Cys-Trp被消化吸收失去活性，另外2個多肽Cys-Met和Cys-Cys則可以抵抗酶的消化作用。趙玉菲等[62]研究體外環(huán)境對大海馬多肽蛋白PH- I活性的影響，將PH- I分離出PH- I1～ PH- I4結果表明溫度對PH-I3活性沒有影響，PH-I3多肽在中性和堿性的條件下具有良好的穩(wěn)定性，但在高糖、高鹽下易失活。一些食源性ACE抑制肽具有較高的抑制活性，但經(jīng)過人體腸胃消化分解后卻沒有體現(xiàn)出抑制作用，可能的原因之一是氨基酸序列的肽鍵易受外界腸胃模擬消化系統(tǒng)的蛋白酶水解而導致肽鏈斷裂，從而未形成與ACE有相互作用的肽段[63]。

6 展望

ACE抑制肽日趨成為研究的熱點，因其高效的降壓作用，可穩(wěn)定改善大鼠的高血壓癥狀，而受到廣泛關注。在體外和體內試驗中進一步驗證ACE抑制肽具有安全有效、無毒副作用、易消化吸收、長期服用能穩(wěn)定降壓等優(yōu)點。近年來，隨著我國高血壓人群數(shù)量在不斷攀升，開發(fā)食源性ACE抑制肽有利于改善服用化學合成抑制劑的高血壓患者的多種不良反應。目前，ACE抑制肽在制備工藝、分離純化技術及構效關系等領域研究較為完善，但仍有不足之處，混合肽制備降壓藥成本昂貴；分離純化過程中多肽損失較多；加工環(huán)境下多肽活性難以保留，且其在胃腸消化系統(tǒng)中不能穩(wěn)定被吸收?；旌辖祲弘拈_發(fā)成為天然高效的保健食品還有待進一步探究。因此，鑒定出食源性多肽的氨基酸序列，通過ACE抑制肽與ACE的構效關系分析出高效的純肽，在藥理水平和細胞水平上對純肽進行降壓機理研究，但在保證最大程度地發(fā)揮其降壓效果等方面還有待進一步研究。