董 靖，張露珊，張國棟，劉永濤，劉紹春，楊移斌，艾曉輝，*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430223； 2.岳陽漁美康生物科技有限公司，湖南 岳陽 414100)

克氏原螯蝦()俗稱小龍蝦，屬甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬，于20世紀(jì)30年代由日本引進(jìn)至我國，是我國常見的四大淡水養(yǎng)殖蝦類之一?？耸显r因肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)成分豐富、生長(zhǎng)快、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)深受國內(nèi)外食客青睞，中國也成為世界最大的克氏原螯蝦生產(chǎn)和消費(fèi)國?？耸显r養(yǎng)殖也因此成為近年來具有發(fā)展前景的養(yǎng)殖品種。但近年來隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，種質(zhì)退化、養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)化程度低、疾病頻發(fā)、質(zhì)量安全等因素制約了克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖。其中，進(jìn)入收獲季節(jié)前后發(fā)生的傳染性疾病是克氏原螯蝦健康養(yǎng)殖的主要威脅。5月初至6月初，克氏原螯蝦疾病暴發(fā)面積大，死亡量大，損失嚴(yán)重，因此又稱為“五月瘟”。為了控制病原菌感染導(dǎo)致的各種疾病，使用了大量的化學(xué)抗菌藥物，給克氏原螯蝦的質(zhì)量安全帶來隱患。

雷氏普羅威登斯菌()是一種革蘭氏陰性菌，隸屬于腸桿菌科普羅威登斯菌屬，能導(dǎo)致多種動(dòng)物發(fā)病。此外，該菌是人類的一種致病菌，能引起腹瀉、肺炎和尿道炎等疾病，是一種能通過污染的食品而造成傳播的人獸共患病原菌。因此，2006年國家衛(wèi)生健康委員會(huì)將該菌列為人間傳染的病原微生物名錄。雷氏普羅威登斯菌能導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如巴西龜()、對(duì)蝦()、羅非魚()、鰱()等發(fā)病。疫苗和抗菌藥物是治療細(xì)菌性感染的主要手段，目前雷氏普羅威登斯菌病的治療主要依賴化學(xué)抗菌藥物。盡管抗菌藥物對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展起到了積極作用，但藥物的不合理使用極易導(dǎo)致病原菌耐藥性的產(chǎn)生，且在水體中使用抗菌藥物可能對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定程度的污染。

近年來，克氏原螯蝦收獲季節(jié)的暴發(fā)性疾病日益嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失，因此亟待探明克氏原螯蝦“五月瘟”的成因，提出科學(xué)合理的防控方案。2019年5月湖北省潛江市某克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地發(fā)生“五月瘟”，發(fā)病克氏原螯蝦表現(xiàn)為活力和采食量下降、死亡情況嚴(yán)重。剖檢發(fā)現(xiàn)患病蝦的肝胰腺顏色較淺，有部分患病蝦肝胰腺發(fā)白，有積液；腸道內(nèi)容物較健康克氏原螯蝦下降明顯，嚴(yán)重者腸道有腫脹。經(jīng)過病原學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，該病原菌為雷氏普羅威登斯菌；通過回歸感染試驗(yàn)驗(yàn)證了其對(duì)養(yǎng)殖克氏原螯蝦的致病力；進(jìn)一步通過藥敏試驗(yàn)分析了該分離株對(duì)抗菌藥物的敏感性以及抗菌藥物與天然化合物的協(xié)同抑菌作用；本文為克氏原螯蝦“五月瘟”的病因分析、新藥研發(fā)和科學(xué)防控提供了技術(shù)支撐和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病蝦樣品采集于潛江市某克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地；健康克氏原螯蝦，體重(30±2)g，為本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；PCR Master Mix、細(xì)菌基因組提取試劑盒等分子生物學(xué)試劑購自北京天根生化公司；腦心浸液培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基購自青島海博生物有限公司，天然化合物購自成都曼思特公司。

1.2 細(xì)菌分離和純化

取癥狀明顯的克氏原螯蝦在無菌條件下反復(fù)沖洗體表3～5次，無菌剖取病蝦的肝胰腺。將肝胰腺用0.9%無菌NaCl溶液沖洗3～5次后置于組織研磨器中研磨均勻。用接種棒蘸取研磨液在腦心浸液(BHI)固體培養(yǎng)基上劃線，然后將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～20 h。從平板中挑取單菌落繼續(xù)在平板劃線2～3次將細(xì)菌進(jìn)行純化，純化后的細(xì)菌制作甘油菌后保存于-20 ℃，標(biāo)記為L(zhǎng)20190509。

1.3 分離株毒力試驗(yàn)

挑取分離株L20190509的單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。使用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕合♂尀?.5×10、1.5×10、1.5×10、1.5×10、1.5×10CFU·mL5個(gè)濃度梯度備用。從基地選取健康情況良好的克氏原螯蝦180尾，隨機(jī)分為6個(gè)試驗(yàn)組，每組30尾。5個(gè)菌懸液試驗(yàn)組在第2和第3腹節(jié)處注射菌液100 μL，陰性對(duì)照組在相同位置注射0.9%無菌NaCl溶液100 μL。將感染后的克氏原螯蝦暫養(yǎng)于玻璃缸內(nèi)，水溫維持在23～25 ℃，溶氧5.5～7.5 mg·L。感染后每24 h觀察不同組別克氏原螯蝦的臨床表現(xiàn)、攝食、活動(dòng)情況，記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察8 d。無菌采取瀕死克氏原螯蝦的肝胰腺，按1.2節(jié)描述的方法分離病原菌并進(jìn)行鑒定，將得到的死亡數(shù)據(jù)采用Bliss法計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC)。

1.4 生理生化鑒定

取純化的分離株單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。此外，從平板上挑取單菌落用0.9%無菌NaCl溶液稀釋至合適濃度后加入到API20E生化鑒定條中，將按說明書處理好的鑒定條放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后置于ATB 32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行生化鑒定。

1.5 細(xì)菌分子鑒定

按天根公司提供的基因組提取試劑盒說明書提取分離株L20190509的基因組，并以此基因組為模板擴(kuò)增菌株的16S rRNA片段，鑒定采用的通用引物序列為：上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 500 bp，將目的條帶切割回收后進(jìn)行序列測(cè)定。將序列測(cè)定結(jié)果上傳至BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)，選取同源性較高的已知物種序列與L20190509菌株的16S rRNA序列采用MEGA5.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，方法為鄰接法，校正模型為Kimura 2-parameter，通過Bootstraps法自舉數(shù)集1 000次。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用制片擴(kuò)散法研究L20190509菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性。取分離株L20190509菌株的單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。將離心收集的菌體用無菌PBS洗滌3次后重懸至濃度為1.5×10CFU·mL。將菌液均勻的涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，然后將藥敏紙片貼于涂滿菌液的平板上，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抗菌藥物的抑菌圈直徑，每種藥物重復(fù)3次。結(jié)果判定參照杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

選取氟苯尼考與10種天然化合物，根據(jù)CLSI公布的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定不同組合對(duì)分離株L20190509的抑制作用。將氟苯尼考和天然化合物分別用MH培養(yǎng)基在無菌離心管中倍比稀釋，然后取50 μL的氟苯尼考和天然化合物分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使氟苯尼考濃度從第2到10孔(從左到右，64 μg·mL至0.25 μg·mL)依次降低，天然化合物濃度從B到H孔(從上到下，512 μg·mL至8 μg·mL)依次降低。按1.6節(jié)方法制備的菌液用MH培養(yǎng)基稀釋至5×10CFU·mL，取100 μL菌液加到96孔板中，分別設(shè)置陰性和陽性對(duì)照，在28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，記錄氟苯尼考和天然化合物單獨(dú)使用和聯(lián)合使用以后的最小抑菌濃度(MIC)。采用抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)評(píng)價(jià)聯(lián)合使用后的抑菌作用， FICI計(jì)算公式為FICI=MIC/MIC+MIC/MIC。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)為協(xié)同作用(synergism，SYN)；0.54時(shí)為拮抗作用(antagonism，ANT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的培養(yǎng)特性

從肝胰腺分離到的優(yōu)勢(shì)菌株在固體培養(yǎng)基上形成圓形、邊緣整齊、透明或半透明的隆起光滑菌落。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上該分離株無溶血現(xiàn)象，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性短桿菌。

2.2 回歸感染試驗(yàn)

健康克氏原螯蝦經(jīng)注射感染L20190509菌株后出現(xiàn)了不同程度的癥狀和死亡，其中高濃度劑量組的克氏原螯蝦出現(xiàn)了急性死亡，陰性對(duì)照組在整個(gè)攻毒試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)明顯的癥狀，也沒有任何死亡情況發(fā)生，結(jié)果見表1。健康克氏原螯蝦感染后出現(xiàn)了活動(dòng)力下降、反應(yīng)遲緩等癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)，感染克氏原螯蝦肝胰腺顏色變淺甚至發(fā)白，腸道內(nèi)容物減少，腸道有充血和腫脹。從瀕死的克氏原螯蝦肝胰腺中分離到了病原菌，其生長(zhǎng)性狀與L20190509一致。經(jīng)Bliss法計(jì)算得到L20190509菌株對(duì)克氏原螯蝦的LC為9.27×10CFU·mL。

2.3 生化鑒定結(jié)果

將分離株L20190509單菌落重懸后接種于API 20E生化鑒定條，在28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后ATB細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)中鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該分離株的生化特征符合雷氏普羅威登斯菌的特征，與系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)相似度大于98%。生化鑒定結(jié)果如表2所示。

2.4 16S rRNA序列分析

通過PCR擴(kuò)增得到了分離株L20190509的16S rRNA片段，長(zhǎng)度約為1 500 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測(cè)序。將得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖1所示，分離株L20190509與普羅威登斯菌屬BAB-5310(KT254645.1)和雷氏普羅威登斯菌RB151(CP017671.1)聚為一支，同源性為99%。結(jié)合該菌株的生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育將該菌株判定為雷氏普羅威登斯菌。

表1 L20190509菌株感染健康克氏原螯蝦后的死亡率

表2 分離株L20190509的生化鑒定結(jié)果

圖1 L20190509菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA genes sequence of L20190509

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過紙片擴(kuò)散法測(cè)定了分離株對(duì)20種化學(xué)抗菌藥物的敏感性。從表3可見，L20190509分離株對(duì)亞胺培南、頭孢噻肟、恩諾沙星3種藥物敏感，對(duì)氟苯尼考和多西環(huán)素2種藥物中度敏感，對(duì)慶大霉素、妥布霉素、新霉素等15種藥物耐藥。

表3 L20190509分離株對(duì)20種抗菌藥物敏感性

2.6 體外聯(lián)合抑菌作用

從表4可見，氟苯尼考、厚樸酚單獨(dú)使用的MIC分別為16 μg·mL和64 ·mL，當(dāng)二者聯(lián)合使用后其MIC分別為2 μg·mL和 16 μg·mL，經(jīng)過計(jì)算其FICI指數(shù)為0.375。氟苯尼考與厚樸酚聯(lián)用后對(duì)L20190509菌株的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用。

3 討論

近年來隨著克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種疾病所帶來的損失也越來越嚴(yán)重。但由于對(duì)克氏原螯蝦疾病的系統(tǒng)研究資料較少，因此，缺乏較為系統(tǒng)有效的病害防控措施?？耸显r傳染性疾病的主要病原包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等。5月是一年中水溫迅速升高的季節(jié)，同時(shí)也是水溫波動(dòng)較大的月份，給克氏原螯蝦帶來強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)；而隨著水溫的升高導(dǎo)致水體中產(chǎn)生缺氧，亞硝酸鹽和氨氮等有害物質(zhì)的積累。此外，各種病原體液伴隨著水溫的升高而迅速繁殖，導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)的提高。以上因素是“五月瘟”發(fā)生的主要原因。

表4 天然化合物與氟苯尼考(單獨(dú)或聯(lián)合)對(duì)L20190509菌株的最小抑菌濃度

Thune等通過分析的美國克氏原螯蝦感染病例發(fā)現(xiàn)，6例疾病發(fā)生的溫度為28 ℃甚至更高，而僅有2例發(fā)生疾病的溫度為23 ℃。程慧俊研究了2013年5—10月潛江8個(gè)養(yǎng)蝦稻田的水體特征發(fā)現(xiàn)，5月份平均水溫為(30.2±0.44)℃；而王天神等發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦在20 ℃左右時(shí)其相關(guān)免疫因子指標(biāo)較好，具有較強(qiáng)的抗病力，而當(dāng)溫度在30 ℃時(shí)各種酶活力與20～25 ℃時(shí)相比顯著下降。綜合以上研究?jī)?nèi)容可以發(fā)現(xiàn)，5月份以后隨著溫度的上升，水體中的溶解氧下降，克氏原螯蝦的抗病力也隨之下降，較容易造成條件性致病菌入侵機(jī)體，造成各種感染。因此，克氏原螯蝦養(yǎng)殖后期應(yīng)提高養(yǎng)殖水體的含氧量，適當(dāng)提高水體高度，減少克氏原螯蝦因溶解氧不足和水體溫度升高而產(chǎn)生的應(yīng)激，從而減少病原體入侵的幾率。本試驗(yàn)中雷氏普羅威登斯菌感染克氏原螯蝦發(fā)生于5月份，是“五月瘟”的暴發(fā)季節(jié)。因此，推斷該菌是克氏原螯蝦“五月瘟”的病原菌之一。

細(xì)菌性疾病常被認(rèn)為是由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化而導(dǎo)致的疾病，病原菌以條件性致病菌為主。彭博文等從患病克氏原螯蝦體內(nèi)分離到一株病原菌，經(jīng)過鑒定為維氏氣單胞菌，該菌能夠引起克氏原螯蝦攝食下降、行動(dòng)遲緩和暴發(fā)性死亡。張立強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)，異常嗜糖氣單胞菌能感染克氏原螯蝦并導(dǎo)致其死亡。肖寧等從安徽省人工養(yǎng)殖的患病克氏原螯蝦體內(nèi)分離到一株弗氏檸檬酸桿菌，通過回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)克氏原螯蝦具有較強(qiáng)的致病力，進(jìn)一步通過粘附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株通過粘附于細(xì)胞表面導(dǎo)致EPC細(xì)胞病變。以上研究表明，淡水養(yǎng)殖水體中普遍存在的條件性致病菌能感染克氏原螯蝦并導(dǎo)致其出現(xiàn)癥狀甚至大量死亡?？耸显r細(xì)菌性感染一般發(fā)生于4—6月，是克氏原螯蝦大量捕撈上市的季節(jié)，一旦發(fā)生細(xì)菌感染會(huì)給養(yǎng)殖者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

普羅威登斯菌屬是腸桿菌科細(xì)菌，是人腸道的正常菌群之一，是一種食物伴侶菌，極易在食品加工、運(yùn)輸和銷售過程中導(dǎo)致動(dòng)物和人的腸道感染或食物中毒。雷氏普羅維登斯菌能導(dǎo)致多種動(dòng)物的感染性疾病。曹瑞勇等發(fā)現(xiàn)，雷氏普羅威登斯菌能感染黑山羊，導(dǎo)致黑山羊出現(xiàn)流涕、打噴嚏等癥狀。唐海波等從竹鼠體內(nèi)分離到一株病原菌，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)該致病菌屬于雷氏普羅威登斯菌，能導(dǎo)致感染的竹鼠和小鼠模型出現(xiàn)死亡，對(duì)竹鼠具有較強(qiáng)的致病力。此外，雷氏普羅威登斯菌還能引起仔豬、揚(yáng)子鱷等動(dòng)物的感染，導(dǎo)致受感染動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的癥狀甚至大規(guī)模死亡。但該菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的感染報(bào)道較少。張振國等為了分析養(yǎng)殖牙鲆幼魚的死亡原因，從瀕死牙鲆體內(nèi)分離到了雷氏普羅威登斯菌，發(fā)現(xiàn)其能導(dǎo)致牙鲆的死亡，當(dāng)該菌與遲緩愛德華菌共感染時(shí)會(huì)引起牙鲆的大量死亡。陳永林等從海洋館死亡的白鰭鯊的腹腔膿液和心血中分離到了雷氏普羅威登斯菌，通過毒力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌能導(dǎo)致受感染的小鼠出現(xiàn)死亡。戰(zhàn)文斌等從患敗血病的對(duì)蝦體內(nèi)分離到3株病原菌，經(jīng)生理生化鑒定為雷氏普羅威登斯菌，該菌能夠?qū)е轮袊鴮?duì)蝦的嚴(yán)重死亡。此外，雷氏普羅威登斯菌能感染中華鱉、巴西龜?shù)葎?dòng)物。以上研究表明，雷氏普羅威登斯菌可感染的動(dòng)物種類廣泛，對(duì)哺乳類、爬行類、魚類、甲殼類動(dòng)物等均具有較強(qiáng)的致病力。

此外，本試驗(yàn)分析了分離株L20190509對(duì)20種抗菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)大部分受試藥物均不敏感，由此推斷該菌耐藥性較強(qiáng)。該結(jié)果與以往報(bào)道的水產(chǎn)動(dòng)物雷氏普羅威登斯菌的敏感性有所不同，推測(cè)與不同地區(qū)用藥習(xí)慣密切相關(guān)。為了降低耐藥藥物的MIC，通過棋盤法研究了氟苯尼考與天然化合物聯(lián)用的效果。盡管聯(lián)用后氟苯尼考和大部分天然化合物的MIC均有不同程度的降低，但僅厚樸酚與氟苯尼考聯(lián)用后其各自MIC值分別降低了4倍和8倍，其FICI值低于0.5，表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用。但該試驗(yàn)方法具有一定的菌株特異性，在其他菌株中是否具有類似的協(xié)同作用，需擴(kuò)大菌株樣本后進(jìn)一步試驗(yàn)。以上研究報(bào)道了克氏原螯蝦雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定和藥物敏感性，為分析克氏原螯蝦“五月瘟”病原和指導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控提供依據(jù)，為今后以本試驗(yàn)菌株為研究對(duì)象，探明雷氏普羅威登斯菌的致病機(jī)制和感染后克氏原螯蝦的主要病理變化；篩選對(duì)雷氏普羅威登斯菌有聯(lián)合抑菌作用的藥物奠定了基礎(chǔ)。