包瑩瑩，陳衛(wèi)剛，葛聞博，何玉琴，*，楊志杰，周凱仁，楊大鵬，楊亞文，劉莉莉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

雌激素主要由卵巢分泌，通過與哺乳動物下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian axis， HPO)軸中雌激素受體(estrogen receptor， ER)結(jié)合對動物的生殖活動發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。經(jīng)典的雌激素受體包括ERα和ERβ兩種亞型，都屬于核受體蛋白超家族中的成員。有研究表明，敲除ERβ基因的雌性小鼠生育能力明顯減弱，說明ERβ是雌性生殖能力調(diào)節(jié)的重要因素。甘加型藏羊是甘南草地型藏羊的優(yōu)良地方品種之一，典型的季節(jié)性發(fā)情動物，每年7—9月發(fā)情，1年產(chǎn)羔1次，多單胎，繁殖率低。已有研究表明，ERβ在小鼠下丘腦、大鼠垂體及卵巢、山羊垂體等器官中均有表達(dá)，但有關(guān)ERβ在甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸中的表達(dá)鮮有報道。因此，本文以甘加型藏羊?yàn)檠芯繉ο螅\(yùn)用qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法分別檢測mRNA及其蛋白在其發(fā)情周期HPO軸中的表達(dá)和分布，以期探討ERβ對甘加型藏羊發(fā)情周期的影響，并進(jìn)一步研究生殖相關(guān)激素受體對其繁殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與樣品采集

于2019年8月到甘肅省甘南州夏河縣甘加鄉(xiāng)藏羊養(yǎng)殖場選取32只2.5～3.5歲健康且未孕的雌性甘加型藏羊，根據(jù)公羊爬跨試情，參照余四九四期分法將發(fā)情周期分為發(fā)情前期(第14天早上～16天晚上)、發(fā)情期(第0～36 h)、發(fā)情后期(第39～72 h)及間情期(第4天早上～13天晚上)4組，每組8只羊，正常飼養(yǎng)。監(jiān)測至發(fā)情周期各時期中間，處死(頸動脈放血法)試驗(yàn)羊，迅速采取下丘腦、垂體及卵巢，將器官等體積分為兩半，一半迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰柜保存?zhèn)溆?，另一?.9%NaCl溶液稍洗置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 試驗(yàn)儀器

切片機(jī)(上海，科達(dá))，光學(xué)顯微鏡(廈門，麥克奧迪)，熒光定量PCR儀(美國，羅氏)，蛋白電泳裝置(美國，伯樂)，101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京，科偉)。

1.2.2 試驗(yàn)試劑

鏈霉卵白素染色試劑盒(Streptavidin/Peroxidase)、DAB、ERβ一抗、二抗等均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TransZol Up、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、蛋白裂解液等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 ERβ mRNA熒光定量PCR

根據(jù)RNA提取試劑盒說明書分別提取甘加型藏羊發(fā)情周期下丘腦、垂體、卵巢中的總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以20 μL體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI中已有的綿羊和-mRNA序列設(shè)計引物(Primer Premier5.0)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，按TranScriptTip Green qPCR SuperMix說明，20 μL體系三步法進(jìn)行。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，45個循環(huán)；72 ℃延伸10 s。每個樣品做3 次重復(fù)。

1.4 Western blot檢測

表1 引物信息

分別將下丘腦、垂體、卵巢在液氮中充分研磨后各稱取100 mg研磨液，加入蛋白裂解液，冰上充分裂解后4 ℃ 12 000 ×離心5 min，取上清液，按3∶1與4×上樣緩沖液混合，98 ℃水浴變性后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制5%的濃縮膠和12%的分離膠，每孔加8 μL蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后對照Marker預(yù)染條帶切取ERβ(58 ku)和β-actin(42 ku)對應(yīng)膠條，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PBST(PBS+tween 20)溶液充分洗膜后用5%脫脂奶粉封閉20 min，加入，ERβ一抗稀釋液(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，PBST洗膜4 h，再加二抗稀釋液(1∶3 000)37 ℃水浴1 h，PBST洗膜2 h后暗室曝光。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

將固定好的器官包埋制作4 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟處理后微波法抗原修復(fù)10 min， 再用3% HO濕盒37 ℃孵育15 min，之后正常山羊血清工作液(A液)37 ℃封閉15 min，ERβ一抗稀釋液(1∶800)4 ℃孵育過夜后37 ℃孵育2 h，然后用生物素標(biāo)記的二抗(B液)37 ℃孵育15 min，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素親和工作液(C液)37 ℃孵育15 min。每次孵育后均用PBS(0.01 mol·L，pH 7.4)洗滌3次，每次5 min。DAB顯色7 min，蘇木精復(fù)染3 min，返藍(lán)，脫水透明后中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余條件和步驟都相同。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果按2法計算發(fā)情周期不同階段各組織基因相對表達(dá)量；Western blot結(jié)果用Image J軟件分析膠條灰度值。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，統(tǒng)計學(xué)差異用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，值<0.05為差異顯著。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果用Motic SK210型光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERβ mRNA在甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸中的表達(dá)變化

qRT-PCR結(jié)果(圖1)顯示，mRNA相對表達(dá)量在甘加型藏羊發(fā)情周期下丘腦中發(fā)情前期最高，顯著高于其他3個時期(<0.05)，發(fā)情期與發(fā)情后期差異不顯著(>0.05)；垂體中發(fā)情前期最高，顯著高于其他3個時期(<0.05)，發(fā)情期次之，發(fā)情后期最低，與間情期差異不顯著(>0.05)。卵巢中間情期表達(dá)量顯著高于其他3個時期(<0.05)。

2.2 ERβ蛋白在甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸中的表達(dá)變化

Western blot 分析(圖2)發(fā)現(xiàn)，ERβ蛋白在下丘腦中發(fā)情前期表達(dá)量最高，其次為發(fā)情后期、發(fā)情期，間情期最低，發(fā)情后期與間情期差異不顯著(>0.05)，其他各個時期差異顯著(<0.05)；垂體中發(fā)情前期表達(dá)最高，之后開始降低，到間情期達(dá)最低，間情期與其他3個時期表達(dá)差異顯著(<0.05)；卵巢中發(fā)情前期最低，間情期最高，顯著高于其他3個時期(<0.05)，發(fā)情前期和發(fā)情期差異不顯著(>0.05)。

2.3 ERβ陽性產(chǎn)物在甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸中的分布

甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸免疫組織化學(xué)結(jié)果(圖3)顯示，ERβ陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色，所有陰性對照組試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，證明試驗(yàn)所選用的ERβ一抗具有特異性。

對甘加型藏羊發(fā)情周期下丘腦、垂體及卵巢免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，ERβ陽性產(chǎn)物在下丘腦促垂體區(qū)大神經(jīng)元胞體及軸突分布(圖3 A-D)；垂體(圖3 F-I)中主要分布在遠(yuǎn)側(cè)部和中間部嗜酸性細(xì)胞胞漿中，胞核有微弱表達(dá)；卵巢(圖3 K-N)中在生長卵泡顆粒細(xì)胞胞漿和胞核、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞及黃體細(xì)胞胞漿中分布。

A，下丘腦；B，垂體；C，卵巢。沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A， Hypothalamic；B， Pituitary；C， Ovarian. PE， Proestrus; E， Estrus; ME， Metestrus; DE， Diestrus. The different lowercase indicated significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸中ERβ mRNA相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of ERβ mRNA in HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle

圖2 甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸中ERβ蛋白相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of ERβ protein in in HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle

3 討論

3.1 ERβ在下丘腦中的表達(dá)及分布

雌性哺乳動物的生殖生理活動受下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控，且有多種激素及其他因子協(xié)調(diào)作用，其中下丘腦(gonadotrophin-releasing hormone， GnRH)的脈沖式分泌是激活動物發(fā)情周期的關(guān)鍵點(diǎn)，而GnRH的分泌受雌激素的反饋調(diào)節(jié)影響。卵巢分泌的雌激素可以隨血液循環(huán)到達(dá)靶器官與其受體結(jié)合發(fā)揮作用。研究表明，發(fā)情周期中，雌激素可通過正、負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)卵巢、下丘腦和垂體激素的分泌，從而影響動物生殖活動。有研究發(fā)現(xiàn)，ERβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域、卵巢及雄性生殖器中有較高表達(dá)。在大鼠和小鼠下丘腦室旁核內(nèi)均可見ERβ免疫陽性反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，ERβ免疫陽性產(chǎn)物主要在下丘腦促垂體區(qū)大神經(jīng)元胞體及軸突中表達(dá)，mRNA及蛋白在發(fā)情前期相對表達(dá)量最高，之后逐漸減少，到間情期達(dá)最低。ERβ在甘加型藏羊發(fā)情周期下丘腦中的這種動態(tài)差異表達(dá)說明其參與藏羊發(fā)情周期的調(diào)控。據(jù)Maeda等報道，雌激素的反饋?zhàn)饔檬墙鐺isspeptin/GPR54信號系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。雌性綿羊下丘腦弓狀核中Kisspeptin神經(jīng)元介導(dǎo)了雌激素對GnRH和促黃體生成素(luteinizing hormone， LH)釋放的負(fù)反饋?zhàn)饔?。弓狀核中Kisspeptin神經(jīng)元能與GnRH細(xì)胞直接接觸，這些細(xì)胞將雌激素的正、負(fù)反饋效應(yīng)傳遞給GnRH神經(jīng)元，從而調(diào)控季節(jié)性繁殖及發(fā)情周期等繁殖活動。

A、F、K，發(fā)情前期；B、G、L，發(fā)情期；C、H、M，發(fā)情后期；D、I、N，間情期；E、J、O，陰性對照。GC，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；NC，神經(jīng)元；Nu，神經(jīng)細(xì)胞核；AC，嗜酸性細(xì)胞；BC，嗜堿性細(xì)胞；CC，嫌色細(xì)胞；PD，遠(yuǎn)側(cè)部；PI，中間部；FA，卵泡腔；GV，卵母細(xì)胞核；LC，黃體細(xì)胞；TF，卵泡膜；SG，顆粒層。A， F， K， Proestrus; B， G，L， Estrus; C， H，M， Metestrus; D，I，N， Diestrus; E，J，O， Negative control. GC， Glial cell; NC， Nerve cell; Nu， Neuronuclei; AC， Acidophilic cell; BC， Basophilic cell; CC， Chromophobe cell; PD， Pars distalis; PI， Pars intermedie; FA， Follicular antrum; GV， Germinal vesicle; LC， Luteal cell; TF， Theca folliculi; SG， Stratum granulosum.圖3 甘加型藏羊發(fā)情周期HPO軸ERβ陽性反應(yīng)分布Fig.3 The location of positive reaction of ERβ in HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle

3.2 ERβ在垂體中的表達(dá)及分布

垂體是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)分泌腺，控制著動物的生長、發(fā)育、代謝、生殖等重要的生命活動。垂體由腺垂體和神經(jīng)垂體兩大部分組成，其中腺垂體是最主要的部分。性腺分泌的雌激素以內(nèi)分泌方式，下丘腦等腦部器官及垂體自身合成的雌激素以旁分泌或自分泌方式作用于腺垂體，使腺垂體卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)和LH的分泌受到影響，進(jìn)而影響卵巢性激素的合成與分泌，參與調(diào)控動物的生殖生理活動。研究表明，只有當(dāng)足夠高的E信號或增加的E持續(xù)幾個小時時才會引起LH/GnRH激增，進(jìn)而誘導(dǎo)ER、GnRHR等的表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ERβ蛋白存在于大鼠垂體前葉和整個大腦，包括負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素合成和分泌的區(qū)域。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ERβ蛋白在甘加型藏羊發(fā)情周期垂體遠(yuǎn)側(cè)部和中間部表達(dá)，雖然是核受體，但在胞漿高表達(dá)，且mRNA及其蛋白在發(fā)情前期表達(dá)最高，間情期最低，提示ERβ可能主要在腺垂體細(xì)胞胞漿中發(fā)揮其調(diào)控發(fā)情周期的作用。

3.3 ERβ在卵巢中的表達(dá)及分布

卵巢作為主要的雌性生殖器官，兼有外分泌(產(chǎn)生并排出卵子)和內(nèi)分泌(分泌雌激素和孕酮)的雙重功能，在雌性生殖中占主導(dǎo)作用。免疫組織化學(xué)研究表明，ERβ免疫陽性產(chǎn)物廣泛存在于卵巢生長卵泡顆粒細(xì)胞胞漿和胞核、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞及黃體細(xì)胞胞漿中，這與鄭可佳等的研究結(jié)果一致?；蚯贸笮猿墒旌蟊憩F(xiàn)出不孕不育，研究發(fā)現(xiàn)，突變大鼠的不孕癥和突變小鼠的不育與卵巢雌激素的分泌中斷有關(guān)，卵巢顆粒細(xì)胞表達(dá)ERβ，ERβ的缺失會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞對促性腺激素的反應(yīng)性降低，并抑制卵泡成熟。此外，ERβ的破壞可能對顆粒細(xì)胞內(nèi)促性腺激素驅(qū)動的細(xì)胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生抑制作用。筆者發(fā)現(xiàn)，甘加型藏羊發(fā)情周期卵巢中mRNA及其蛋白在間情期表達(dá)最高，此時新一輪發(fā)情周期的黃體已經(jīng)完全發(fā)育成熟，大量分泌雌激素和孕酮，雌激素與ERβ結(jié)合發(fā)揮其影響動物發(fā)情、排卵等生殖活動的功能。

3.4 雌激素受體與動物繁殖的關(guān)系

近年來，雌激素受體在動物繁殖力調(diào)控的研究受國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。在小鼠中，基因的缺失會使卵巢出現(xiàn)血性卵泡或囊腫性卵泡，甚至導(dǎo)致雌性不育，基因的缺失導(dǎo)致卵巢缺陷，卵泡數(shù)量明顯減少以及排卵受到抑制，繁殖率降低。結(jié)合我們先前的研究結(jié)果，和基因及其蛋白在甘加型藏羊發(fā)情周期下丘腦-垂體-卵巢軸中均有表達(dá)，但二者的表達(dá)存在差異性:下丘腦中ERα在發(fā)情后期表達(dá)量最高，垂體中在發(fā)情期最高，卵巢中在發(fā)情前期最高；而ERβ在下丘腦和垂體中均在發(fā)情前期表達(dá)量最高，在卵巢中間情期最高，且垂體中ERβ的表達(dá)量高于ERα，但卵巢中又以ERα為優(yōu)勢表達(dá)，說明雌激素在甘加型藏羊發(fā)情周期不同階段、不同器官中與ERα和ERβ結(jié)合能力不同，故推測ERα和ERβ在動物繁殖活動中擔(dān)任不同的角色，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，ERβ在甘加型藏羊發(fā)情周期下丘腦-垂體-卵巢軸中均有分布，其mRNA和蛋白在下丘腦中和垂體中發(fā)情前期表達(dá)量最高，在卵巢中間情期表達(dá)最高，ERβ的這種動態(tài)差異表達(dá)，提示ERβ在甘加型藏羊發(fā)情周期不同階段中具有重要的生物學(xué)作用。推測ERβ可能通過影響下丘腦GnRH、垂體FSH和LH及卵巢雌激素和孕酮等生殖相關(guān)激素分泌水平的變化，進(jìn)而調(diào)控發(fā)情周期及卵泡的生長發(fā)育等生殖活動，但相關(guān)機(jī)制有待深入研究。