急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見急腹癥，全球發(fā)病率呈逐年上升的趨勢

。膽石癥、酒精、高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是AP的三大常見病因。國內(nèi)最新一項Meta分析顯示，在我國，高甘油三酯血癥性急性胰腺炎(hypertriglyceridemic pancreatitis，HTGP)的發(fā)生率已超過酒精性AP，成為繼膽源性胰腺炎之后AP的第二大常見病因

。研究表明，合并HTG的AP患者出現(xiàn)重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)和器官衰竭的比率更高

。動物實驗也顯示HTG可加重AP大鼠胰腺組織損傷

。然而，目前HTGP的發(fā)病機制尚不明確，因此，闡明HTGP的發(fā)病機制、提出更有效的預(yù)防和治療措施成為改善HTGP預(yù)后的關(guān)鍵。細胞間緊密連接(tight junctions，TJs)是維持上皮細胞結(jié)構(gòu)與功能完整的重要超微結(jié)構(gòu)，是維持黏膜屏障功能的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，長期大量游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)刺激，能導(dǎo)致上皮細胞收縮，細胞間TJs減弱，脂質(zhì)易于浸潤，致使上皮黏膜屏障受到破壞

。本研究通過建立大鼠HTGP模型，觀察胰腺病理改變、胰管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)，采用免疫組織化學法、免疫印跡法檢測組織中細胞間緊密連接蛋白脂解刺激脂蛋白受體(lipolysis-stimulated lipoprotein receptor，LSR)、Tricellulin蛋白(TRIC)、ZO-1、occludin、claudin-7的表達，研究HTG對大鼠AP胰腺組織TJs蛋白的影響，進而探討HTGP發(fā)病的特征及可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1.1 實驗動物：4周齡體質(zhì)量60～80 g的SPF級健康雄性SD大鼠，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心(動物許可證號：SCXK桂2014-003)。

1.1.2 實驗分組：48只SD大鼠隨機分為普通飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)組，兩組各24只,分別給予普通飼料及高脂飼料(82.8%普通飼料+15%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂養(yǎng)。4周后行眶后靜脈取血檢測血清甘油三酯(triglyceride,TG)水平。普通飼養(yǎng)組進一步隨機分為C組和AP組，高脂飼養(yǎng)組隨機分為HTG組和HTGP組,每組各12只。AP組和HTGP組經(jīng)腹腔注射雨蛙肽誘發(fā)AP，劑量為50 μg/kg，分7次注射，每次間隔1 h；C組和HTG組經(jīng)腹腔注射同等劑量生理鹽水，實驗過程中無小鼠死亡。各組于造模后24 h、48 h處置大鼠，腹正中切口打開腹腔，循胃流出道方向找到十二指腸，暴露十二指腸內(nèi)側(cè)的胰腺組織，觀察胰腺大體病變情況，主胰管位于胰腺組織靠近十二指腸降部位置，為一白色半透明導(dǎo)管自肝門延伸至十二指腸降部，分離主胰管置2%的鋨酸固定液固定，取適量胰腺組織于4%多聚甲醛溶液固定，我院分離剩余胰腺組織置-80 ℃冰箱保存。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準，批號：202005011。

普通飼養(yǎng)大鼠血清呈清亮淡黃色，高脂飼養(yǎng)大鼠血清呈混濁乳糜樣，普通飼養(yǎng)組和高酯飼養(yǎng)組大鼠的血清TG水平分別為(323.15±71.33)μmol/L和(537.06±142.45)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見圖1)。

該研究是對吉安（油田話）的單字調(diào)調(diào)值的第一次具體研究，通過所得的實驗數(shù)據(jù)，得出結(jié)論：年青者（23歲）調(diào)類的基頻整體上低于其他兩位年長發(fā)音人的基頻，年長者（68歲）的陽平尾端有明顯的下降，不同于其他兩位發(fā)音人，說明年齡差異影響到調(diào)類變化，歷史上陽平有可能是個升降調(diào)，為了證明這一想法，筆者將會在另一論文中進行證明。因此，暫且認為油田方言總共有四個調(diào)類，陰平，陽平，上聲和去聲，入聲歸入陰平和去聲。

正長斑巖（K1ξπ）：出露于沃布滾陶勒蓋、森德敖林等地，呈小巖株狀產(chǎn)出，巖體侵入白音高老組、寶力高廟組組和安格爾音烏拉組。花崗閃長斑巖（K1 γδπ）：出露于吉仁臺高吉高爾高地一帶，呈小巖株狀產(chǎn)出，巖體侵入寶力高廟組和白音高老組。

C組大鼠胰腺組織鏡下無明顯病理改變，HTG組胰腺組織偶有輕微小葉間水腫，部分見炎癥細胞浸潤，HTG組病理評分高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)；AP組及HTGP組胰腺病理損傷以水腫、炎癥細胞浸潤為主，偶有出血，未見明顯胰腺壞死，以24 h病理損傷最明顯；各時點的AP組和HTGP組病理評分均顯著高于C組及HTG組(

<0.05)，各時點的HTGP組病理評分與相應(yīng)時點的AP組間差異無統(tǒng)計學意義(

>0.05)，但HTGP 24 h組與AP 48 h組病理評分差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見圖2)。

鏡下可見LSR、claudin-7主要表達在細胞質(zhì)頂端近細胞膜處，以腺泡細胞表達顯著；TRIC主要表達在細胞膜上，以胰腺導(dǎo)管上皮細胞表達顯著；occludin主要在腺泡細胞膜處濃聚，細胞質(zhì)也有較多量表達，胰腺導(dǎo)管上皮細胞少量表達。HTG組LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達低于C組，其中LSR和TRIC表達差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)；鏡下可見AP組與HTGP組細胞膜上的TJs蛋白均明顯減少，AP 24 h組LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達均低于C組(

<0.05)，HTGP 24 h組上述蛋白表達低于HTG組(

<0.05)；HTGP 24 h組的LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達低于AP 24 h組，其中LSR和TRIC在HTGP 24 h組和AP 24 h組表達差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見圖3)。

“情”乃是人們的個人情感，是人們在某件事情發(fā)生后，判斷、評價這件事情發(fā)生過程中的道德行為時的內(nèi)心活動。道德情感基于個人的道德認識，顯然兩者關(guān)聯(lián)密切、互相促進，道德行為的內(nèi)在動力就是個人的道德情感。

2 結(jié)果

1.2.1 胰腺組織病理學檢查：胰腺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定72 h后常規(guī)行石蠟包埋、切片、HE染色，根據(jù)Van Laethem標準(見表1)

從水腫、炎癥細胞浸潤、腺泡壞死3個方面進行雙盲胰腺病理評分。

西方文藝復(fù)興的出現(xiàn)。荷蘭學者伊拉斯謨(Erasmus)在給朋友的一封信中提到，歐洲將迎來一個歷史上的“黃金時刻”，法國人稱為“文藝復(fù)興”，“這個復(fù)興就是指突然而又不可逆轉(zhuǎn)地使歐洲人與世界上其他人區(qū)分開來的力量?！盵5]283從學術(shù)到藝術(shù)，新思想競相迸發(fā)，文藝復(fù)興表現(xiàn)出一個驚人的方面，即重修文物的行為產(chǎn)生了發(fā)明和開放式求知這樣的非傳統(tǒng)文化。新思想從佛羅倫薩一路傳播至葡萄牙、波蘭以及英國。文藝復(fù)興的出現(xiàn)給西方，尤其是歐洲國家?guī)砹宋幕I(lǐng)域的繁榮，而這種繁榮迫使15世紀的歐洲經(jīng)歷了兩次結(jié)局不同的軸心思想的影響。與其說是新冒險的發(fā)現(xiàn)，倒不如說是西方的治理文明是試圖擴張政治的影響力。

三、我國獸醫(yī)管理體制改革的建議機構(gòu)不健全、基層動物防疫體系薄弱，缺乏專業(yè)人才，法律不完善、等問題，嚴重影響了動物疫病防治能力和動物產(chǎn)品質(zhì)量安全水平的提高。加之目前國際上特別是我周邊國家重大動物疫病時有發(fā)生，甚至出現(xiàn)局部蔓延，對我國防控重大動物疫病形成較大壓力。因此，改革獸醫(yī)管理體制已經(jīng)成為當前十分緊迫的任務(wù)。

1.2.2 免疫組織化學法檢測胰腺組織LSR、TRIC、occludin、claudin-7表達量：取C組、AP 24 h組、HTG組和HTGP 24 h組胰腺石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、枸櫞酸鈉溶液微波抗原修復(fù)20 min，用通用型SP-9000免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋公司)行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷10 min、山羊血清封閉20 min，一抗LSR(1∶200，英國Abcam，貨號:ab232780)、TRIC(1∶100，美國Sigma-Aldrich，貨號:SAB1306444)、occludin(1∶1 000，武漢三鷹，貨號:13409-1-AP)、claudin-7(1∶100，上海生工，貨號:D151730)4 ℃孵育過夜，再予山羊抗兔IgG聚合物室溫孵育15 min、HRP標記鏈酶卵白素常溫孵育10 min、DAB顯色5 min、蘇木精復(fù)染1 min，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察胰腺組織的染色強度及范圍。每張切片隨機選取5個高倍視野(放大400倍)，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件獲取平均光密度值(

)行半定量分析。

1.2.3 主胰管上皮細胞透射電鏡觀察：取C組、AP 24 h組、HTG組、HTGP 24 h組大鼠主胰管組織經(jīng)固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后，在透射電鏡(日立H-7650)下觀察主胰管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)及TJs變化。

C組及HTG組主胰管上皮細胞可見TJs、橋粒/半橋粒連接，AP 24 h組及HTGP 24 h組主胰管上皮細胞TJs較C組及HTG組減少，甚至消失，且細胞間隙明顯增寬，其中HTGP 24 h組細胞間隙較AP 24 h組增寬更明顯(見圖4)。

3 討論

TJs是由多種蛋白及分子構(gòu)成的具有多種功能的大分子復(fù)合物，廣泛存在于所有上皮或內(nèi)皮細胞間連接的最頂端，并且具有屏障功能

。TJs包括雙細胞間緊密連接(bicellular tight junctions，bTJs)和三細胞間緊密連接(tricellular tight junctions，tTJs)。bTJs主要是由occludin和claudins蛋白家族連接構(gòu)成。tTJs則由TRIC和angulins蛋白家族組成。

動物研究表明，在AP時，胰腺腺泡細胞及導(dǎo)管上皮細胞膜occudin、claudins蛋白、ZO-1表達均減少或消失

。本研究結(jié)果與前述研究類似：occludin、claudin-7和ZO-1在胰腺炎組的表達均低于非胰腺炎組。TRIC位于三細胞連接的頂部，是維持上皮屏障的重要結(jié)構(gòu)。它在正常人體胰腺腺泡和導(dǎo)管細胞均有定位表達，而胰島細胞中無表達，TRIC在分化良好的胰管腺癌中過表達，但在低分化腺癌中表達較弱

。LSR，又稱angulin-1，是angulins蛋白家族中發(fā)揮作用的核心蛋白，定位于三細胞連接的中心，主要作用是調(diào)控TRIC的表達，募集TRIC于三細胞連接處，維持tTJs的形態(tài)

，敲除LSR后，細胞膜上TRIC的表達也隨之消失

。體外研究表明，敲除LSR后，正常人胰腺導(dǎo)管上皮細胞及子宮內(nèi)膜細胞的上皮屏障均受到破壞，而人胰腺癌細胞及子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移、侵襲、增殖能力明顯增強

，用EGF或TGF-β治療后可增加LSR的表達，并誘導(dǎo)LSR和TRIC從tTJs定位到bTJs

。正如前所述，目前關(guān)于TRIC和LSR的研究大多與腫瘤性疾病相關(guān)，而與AP相關(guān)研究極少。在本研究中，TRIC和LSR在AP狀態(tài)下表達減少，與胰腺損傷程度成反比，提示可能因TRIC和LSR表達下降所致的黏膜屏障損傷而加重胰腺病理損傷。

此外，本課題組前期研究表明，HTG患者更容易出現(xiàn)SAP，其發(fā)生風險與血清TG水平呈正相關(guān)

，動物模型也提示HTGP大鼠胰腺病理損傷比非高脂AP更嚴重

。在本研究中，HTGP的胰腺損傷亦重于非高脂的AP模型。此外，本研究尚顯示tTJs相關(guān)蛋白TRIC和LSR在HTGP中表達下降程度亦高于AP模型，而bTJs相關(guān)蛋白表達則無上述情況，提示在AP過程中，HTG可能通過削弱胰腺上皮細胞的TJs加重胰腺病理損傷，且該作用可能更多作用于tTJs而非bTJs。

本研究結(jié)果顯示，緊密連接蛋白LSR、TRIC、ZO-1、occludin、claudin-7在HTG及HTGP大鼠胰腺組織中表達較非高脂模型下降，其中以tTJs相關(guān)蛋白LSR及TRIC下降更明顯，提示AP時，HTG可能通過削弱胰腺上皮細胞TJs，尤其是tTJs加重胰腺損傷，為HTGP的治療提供新思路。

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