張雪鈴 張朝然

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD)是角膜移植術(shù)最常見(jiàn)的指征之一，其特征是角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cell，CEC)進(jìn)行性喪失、后彈力層(descements membrane，DM)增厚以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)以疣贅(guttae)的形式沉積[1]。FECD的全球發(fā)病率為4%～9%，依據(jù)人種、地區(qū)的不同略有差異，其中，新加坡華人的發(fā)病率約為6.7%[2]。一項(xiàng)中國(guó)人群占主體(72.7%)的亞洲研究[3]顯示，在所有接受角膜移植手術(shù)的患者中，有7.1%是以FECD為手術(shù)指征。根據(jù)發(fā)病年齡，F(xiàn)ECD可分為早發(fā)型FECD(40歲以下)和晚發(fā)型FECD(40歲以上)2種，晚發(fā)型FECD更為常見(jiàn)，且多為女性患者；而較為罕見(jiàn)的早發(fā)型FECD無(wú)性別差異[4]。FECD呈常染色體顯性遺傳，遺傳因素在FECD的發(fā)病中具有重要作用，一項(xiàng)涉及322個(gè)FECD家庭的研究[5]表明，其遺傳率高達(dá)37%～39%。目前，引起FECD的主要病因尚未明確，但了解該病相關(guān)的遺傳背景和發(fā)病機(jī)制為FECD的早期診斷及病因治療提供更多潛在機(jī)會(huì)，故本文就此進(jìn)行綜述。

1 遺傳背景

1.1 早發(fā)型FECDCOL8A2基因。COL8A2基因在1979年由Magovern等[6]首次報(bào)道，是目前唯一與早發(fā)型FECD相關(guān)的基因，位于1號(hào)染色體p34.3-p32區(qū)域，負(fù)責(zé)編碼Ⅷ型膠原蛋白-α2，即COL8A2蛋白。在成人的眼部結(jié)構(gòu)中，COL8A2蛋白是一種關(guān)鍵的ECM蛋白，呈線狀或纖維狀分布于DM，而早發(fā)型FECD患者角膜內(nèi)COL8A2蛋白在DM大量累積，導(dǎo)致DM增厚，進(jìn)而形成疣贅[7]。韓國(guó)一項(xiàng)回顧性分析[8]顯示，約15%的FECD患者攜帶COL8A2基因突變，且基因突變患者的角膜移植率遠(yuǎn)高于非基因突變患者(60.0%vs19.2%)。

Jun 等[9]首先在小鼠模型上證實(shí)，COL8A2基因中位于第455位的賴氨酸被谷氨酰胺取代(Q455K)足以引起FECD。Matthaei等[10]發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenases，COX-2)和Jun原癌基因(JUN)在COL8A2Q455K/Q455K突變小鼠模型中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，COX-2通過(guò)分泌二十烷樣前列腺素E2來(lái)影響CEC在形態(tài)、有絲分裂和遷移方面的變化；而Jun是一種激活蛋白-1復(fù)合物蛋白，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程，兩者都為FECD發(fā)病機(jī)制的研究提供了指引。Uehara等[11]基于CRISPR/cas9技術(shù)對(duì)COL8A2Q455K/Q455K突變的成年FECD小鼠模型進(jìn)行基因編輯，在COL8A2起始密碼子處進(jìn)行切割、消化，沉默COL8A2的基因表達(dá)，對(duì)FECD成年小鼠的角膜內(nèi)皮具有一定修復(fù)作用，這為早發(fā)型FECD的治療及預(yù)防提供了新思路。

COL8A2基因中另一突變位點(diǎn)L450W(基因第450位的亮氨酸轉(zhuǎn)化為色氨酸)由John等[12]首先發(fā)現(xiàn)，較為罕見(jiàn)。普通遲發(fā)型FECD患者的疣贅較大，常首發(fā)于細(xì)胞-細(xì)胞連接處，靠近內(nèi)皮細(xì)胞的基底外側(cè)面；而L450W突變患者的疣贅小而圓，位于內(nèi)皮細(xì)胞中心處[13]。 Meng等[14]研究了L450W和Q455K兩種突變位點(diǎn)的差異，發(fā)現(xiàn)L450W突變小鼠比Q455K突變小鼠所表現(xiàn)出來(lái)的疾病表型更溫和，細(xì)胞自噬標(biāo)志物Dram1的陽(yáng)性率分別為對(duì)照組的2.1倍(L450W)和5.2倍(Q455K)，而Dram1與未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的上調(diào)和自噬的激活有關(guān)，說(shuō)明UPR與自噬在COL8A2基因突變引起的疾病發(fā)病過(guò)程中可能起到一定作用。

1.2 遲發(fā)型FECD

(1)TCF4基因。TCF4基因位于18號(hào)染色體q21.2區(qū)域內(nèi)，負(fù)責(zé)編碼螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子4[15]。由TCF4編碼的E蛋白家族成員E2-2在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中具有許多重要作用，包括參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過(guò)程等，是FECD的主要促成因素之一[16]。有研究[17-19]顯示，約70 %以上的高加索FECD患者與TCF4基因內(nèi)的CTG三核苷酸重復(fù)(trinucleotide repeat，TNR)顯著相關(guān)，CTG TNR以長(zhǎng)度依賴的方式調(diào)節(jié)TCF4基因的啟動(dòng)子活性，擴(kuò)增程度越大，啟動(dòng)子的活性越低，疾病程度也更重。另有研究[20]證明，F(xiàn)ECD患者的CTG TNR外顯率隨年齡增長(zhǎng)而增加，在50歲以下人群中外顯率為44.4%，而50歲以上人群中外顯率高達(dá)86.2%。CTG TNR在中國(guó)的FECD患者中約占24.6%，在健康人群中約占0.9%，其優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)高達(dá)66.5，是中國(guó)人群在該基因的主要變異[21]。在CTG TNR突變的FECD患者中，21.8%的患者接受了角膜移植手術(shù)，相比CTG未突變的FECD患者，風(fēng)險(xiǎn)增加了1.64倍[22]。Chu等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，從早期的CTG TNR引起RNA的錯(cuò)誤剪切和ECM基因表達(dá)的改變，到晚期FECD的嚴(yán)重癥狀至少需20年，且早期和晚期FECD患者較健康人群而言，其RNA剪切改變的絕對(duì)值基本一致。故對(duì)有家族史或疑似FECD患者進(jìn)行CTG TNR的篩查，可起到早期診斷的作用。

除CTG TNR外，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與FECD的關(guān)聯(lián)性也被許多學(xué)者研究和認(rèn)可。Baratz等[16]在2010年發(fā)現(xiàn)了TCF4基因內(nèi)的4種SNP與FECD獨(dú)立相關(guān)，分別為rs613872、rs17595731、rs2286812和rs9954153，其中rs613872在FECD患者和對(duì)照組中的頻率分別為40%和15%，雜合子和純合子的OR值分別為5.5和30。rs613872與FECD的關(guān)聯(lián)性在高加索人種中的頻率高達(dá)37%～82%，與健康對(duì)照組相比，其OR值高達(dá)4.05～12.5[17,24-25]。然而，TCF4基因的SNP與FECD的相關(guān)性因種族背景的不同而產(chǎn)生較大差別。Okumura等[26]在泰國(guó)人群中只發(fā)現(xiàn)了1.9%的FECD患者有rs613872。Rao等[27]在印度人群中發(fā)現(xiàn)rs17595731的OR值遠(yuǎn)高于rs613872(15.3vs. 3.6)。Nanda等[28]在印度人群中的調(diào)查未發(fā)現(xiàn)rs613872與FECD具有關(guān)聯(lián)性，但新發(fā)現(xiàn)的rs17089887與FECD顯著相關(guān)(OR：2.37)。對(duì)于中國(guó)人群的研究，Thalamuthu等[29]未觀察到rs613872與FECD有關(guān)聯(lián)，但發(fā)現(xiàn)rs17089887與FECD密切相關(guān)(OR：2.3)。故對(duì)于亞裔人群而言，rs17089887可能比rs613872更具研究意義。

Okumura等[30]分別研究了TCF4基因內(nèi)的SNP和CTG TNR，發(fā)現(xiàn)rs613872雖與FECD高度相關(guān)，但與TCF4的表達(dá)水平無(wú)關(guān)；然而CTG TNR的長(zhǎng)度與TCF4的表達(dá)水平呈正相關(guān)。除此之外，有研究[17]統(tǒng)計(jì)了美國(guó)、歐洲、印度、中國(guó)、日本和俄羅斯FECD患者的10種不同基因突變(包括TCF4、SLC4A11、LOXHD1和AGBL1)的發(fā)生率后，發(fā)現(xiàn)TCF4基因中的CTG TNR是晚發(fā)型FECD的最佳篩查、診斷標(biāo)志。綜上，由于SNP種類多且在不同種族內(nèi)有較大差異，故CTG TNR可能是更好的、全球性的FECD疾病預(yù)測(cè)指標(biāo)。

(2)SLC4A11基因。SLC4A11基因位于20號(hào)染色體p13區(qū)域，其表達(dá)的SLC4A11蛋白是碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC4家族的成員之一，但人類的SLC4A11蛋白不負(fù)責(zé)碳酸氫鹽或硼酸鹽的運(yùn)輸，而是起到輸送水分和氨的作用，約有11%的FECD患者與該基因的突變有關(guān)[31]。SLC4A11蛋白位于CEC基底外側(cè)面，與水通道蛋白1協(xié)同驅(qū)動(dòng)水分從角膜基質(zhì)轉(zhuǎn)移到房水中，以維持角膜內(nèi)外的液體平衡，若SLC4A11基因缺陷，將導(dǎo)致角膜基質(zhì)中的液體積聚[32]。此外，位于CEC表面的SLC4A11蛋白還作為細(xì)胞黏附分子直接與DM結(jié)合，SLC4A11缺陷的FECD患者的CEC試圖通過(guò)過(guò)度分泌ECM成分的方式來(lái)彌補(bǔ)DM的粘連減弱，但依然無(wú)法修補(bǔ)，最終導(dǎo)致CEC細(xì)胞丟失、DM厚度增加和疣贅的形成[33]。Zhang等[34]的研究表明，CEC通過(guò)谷氨酰胺分解代謝產(chǎn)生大量三磷酸腺苷(ATP)來(lái)維持其功能，而SLC4A11缺陷患者的CEC中，這種谷氨酰胺分解會(huì)中斷，嚴(yán)重影響角膜內(nèi)皮的水分轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致角膜透明性下降。Guha等[35]發(fā)現(xiàn)SLC4A11是CEC中核因子-紅細(xì)胞2相關(guān)因子-2(nuclear factor-erythroid 2-related factor-2，Nrf-2)介導(dǎo)的抗氧化基因表達(dá)過(guò)程中必不可少的一環(huán)，過(guò)表達(dá)SLC4A11可降低活性氧水平，增加細(xì)胞活力，而SLC4A11缺陷會(huì)降低對(duì)CEC的保護(hù)作用，推進(jìn)FECD疾病進(jìn)展。Alka等[36]的研究顯示，大多數(shù)錯(cuò)義突變并不影響SLC4A11蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，暗示其功能障礙才是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的潛在機(jī)制。Malhotra等[37]研究了與FECD相關(guān)的3種SLC4A11突變體(v1、v2和v3)，發(fā)現(xiàn)v2表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)含量最多，且v2中的開放閱讀框 (M36)為主要突變位點(diǎn)，在水分運(yùn)輸上占主導(dǎo)地位，而v3可能在蛋白之間的相互作用和調(diào)控途徑中起到一定作用，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

(3)ZEB1基因。ZEB1基因位于10號(hào)染色體p11.2區(qū)域，負(fù)責(zé)編碼鋅指同源框結(jié)合(zinc-finger E homeobox-binding，ZEB)蛋白，也被稱為TCF8[38]。有研究[39]發(fā)現(xiàn)，ZEB1基因的錯(cuò)義突變推進(jìn)FECD疾病病程。Gupta等[40]在印度人群中研究了由ZEB1突變引起FECD的11種SNP，其中rs220060在FECD患者中的突變頻率高達(dá)24%，而對(duì)照組只有4%，與FECD的發(fā)病高度相關(guān)。Rao等[41]研究顯示，約2%的FECD患者攜帶ZEB1突變，作者們還新發(fā)現(xiàn)了2種ZEB1相關(guān)SNP(rs549284707和rs118020901)，其生物信息分析結(jié)果顯示2種突變均可對(duì)CEC產(chǎn)生有害影響。Okumura等[42]的研究表明，與正常角膜的CEC相比，F(xiàn)ECD患者的CEC中ZEB1基因呈高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致CEC合成過(guò)多的ECM，因而推測(cè)ZEB1基因參與了FECD的病理過(guò)程。

然而，Chung等[43]的研究發(fā)現(xiàn)ZEB1的錯(cuò)義突變并沒(méi)有改變ZEB1蛋白的豐度及它在細(xì)胞核內(nèi)的定位。目前，Tang等[44]未在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)ZEB1突變對(duì)FECD的疾病程度有影響。因此這些錯(cuò)義突變對(duì)ZEB1功能的影響及ZEB1與FECD的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

(4)其他。Afshari等[45]對(duì)2 075例FECD患者和3 342例對(duì)照進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)，確定了3個(gè)重要位點(diǎn)，分別是KANK-4基因的rs79742895、LAMC-1基因的rs3768617和ATP1B1基因的rs1200114，且LAMC-1在女性中風(fēng)險(xiǎn)更高。Wójcik等[46]觀察到XRCC1基因的A等位基因與FECD呈正相關(guān)，而G等位基因與FECD負(fù)相關(guān)，NEIL-1基因與FECD發(fā)病率的升高呈弱相關(guān)。Synowiec等[47]發(fā)現(xiàn)FAS基因的G等位基因增加FECD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而A等位基因和C/C-A/A聯(lián)合基因型可降低該風(fēng)險(xiǎn)。此外，LIG3基因在g.29059C＞T的多態(tài)性與FECD發(fā)生率降低相關(guān)，RAD51基因的G/C基因型和C等位基因促進(jìn)FECD的發(fā)生，而G/G基因型和G等位基因具有保護(hù)作用[48-49]。

2 發(fā)病機(jī)制

2.1 線粒體功能障礙 在FECD疾病早期，CEC通過(guò)增加線粒體密度、線粒體鈣濃度和線粒體膜電位，來(lái)產(chǎn)生更多的ATP，以彌補(bǔ)CEC的數(shù)量損失。但這同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)氧化程度不斷增加，直至產(chǎn)生不可逆的氧化損傷，如線粒體DNA耗竭、線粒體功能障礙、碎片化[50]。而線粒體功能障礙導(dǎo)致ATP生成減少，不足以維持Na+-K+-ATP酶的功能，即CEC泵功能障礙，從而引起患者角膜水腫、視力下降[51]。此外，ATP水平的降低也激活了AMP活化蛋白酶(AMPactivated protein kinase，AMPK)及其下游底物p53和類Unc-51自噬激活激酶1 (Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)，分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組的改變和線粒體自噬的增加[52]。在FECD患者的CEC中，線粒體表現(xiàn)出以分裂(fission)為主的形態(tài)，線粒體自噬作用上調(diào)，最終引起線粒體密度降低[53]。線粒體自噬也會(huì)造成線粒體融合蛋白——絲裂菌素2(mitofusin 2，Mfn2)的損失，而Mfn2具有穩(wěn)定線粒體、預(yù)防應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體碎裂和自噬清除作用，故促成FECD的疾病過(guò)程[54]。

2.2 氧化應(yīng)激 與健康人相比，F(xiàn)ECD患者的CEC中可見(jiàn)氧化-抗氧化失衡和氧化性DNA損傷的積累[55]。正常情況下，線粒體產(chǎn)生低水平的活性氧類(reactive oxygen species，ROS)以維持細(xì)胞的增殖、防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)等生理功能[56]。一些外源性的氧化應(yīng)激刺激如紫外線照射會(huì)增加CEC內(nèi)的ROS[57]。正常CEC內(nèi)存在精準(zhǔn)的氧化-抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以清除過(guò)多的ROS以避免細(xì)胞損傷。而FECD患者由于其細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化功能的Nrf2表達(dá)減少，ROS無(wú)法被及時(shí)清除，造成氧化性線粒體DNA損傷，而損傷的線粒體又會(huì)釋放出更多的ROS，進(jìn)而引起氧化-抗氧化失衡的惡性循環(huán)，最終造成細(xì)胞核DNA損傷和細(xì)胞凋亡[58-59]。也有學(xué)者[60]的研究表明，F(xiàn)ECD患者和對(duì)照組的DNA損傷程度沒(méi)有明顯差異，但FECD患者的DNA損傷修復(fù)能力較低，這可能是氧化應(yīng)激在FECD病理中作用的機(jī)制之一。氧化應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)上調(diào)PINK1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)-Parkin通路，誘導(dǎo)Parkin依賴性蛋白酶體降解，促進(jìn)CEC的線粒體自噬和蛋白質(zhì)降解過(guò)程[61]；也可通過(guò)裂解半胱天冬酶和釋放細(xì)胞色素C，來(lái)激活細(xì)胞的凋亡[51]，從而推動(dòng)FECD病程。

2.3 其他 FECD患者的CEC可通過(guò)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程，引起細(xì)胞間黏附喪失、細(xì)胞-細(xì)胞連接丟失以及內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能和離子泵功能的破壞，從而引起角膜水腫；EMT也與大量ECM蛋白以疣贅的形式沉積有關(guān)，而ECM蛋白沉積是FECD病理過(guò)程的第一步[62-63]。美國(guó)一項(xiàng)研究[64]表明，N-乙酰半胱氨酸可抑制EMT過(guò)程，這可能對(duì)FECD具有一定治療意義。

除此之外，由于CEC具有較高的代謝能力，易發(fā)生內(nèi)質(zhì) 網(wǎng) 應(yīng) 激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和UPR，也可通過(guò)此途徑誘導(dǎo)CEC的凋亡[65]。在FECD患者CEC中，TGF-β和TGF-β受體的表達(dá)水平較高，誘導(dǎo)ECM蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中逐漸超負(fù)荷累積，ECM蛋白的過(guò)度合成誘導(dǎo)了FECD患者的CEC中未折疊蛋白數(shù)量的增加，UPR激活內(nèi)源性的凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[66-67]。

3 結(jié)語(yǔ)

FECD主要分為早發(fā)型和遲發(fā)型2類，目前只發(fā)現(xiàn)了COL8A2基因突變與早發(fā)型FECD相關(guān)，而晚發(fā)型FECD的遺傳因素較多，主要受TCF4、SLC4A11和ZEB1基因影響，其中TCF4基因的CTG TNR突變?cè)诓煌N族人群中檢出率最高，是較為推薦的全球性的FECD預(yù)測(cè)指標(biāo)。FECD的發(fā)病機(jī)制包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、EMT以及ERS與UPR，前2種機(jī)制被廣泛研究與認(rèn)可，而后者還需更多研究證實(shí)。目前，F(xiàn)ECD的病因仍不清楚，仍有必要對(duì)其遺傳背景和發(fā)病機(jī)制展開進(jìn)一步研究。