宋紅濤，焦東亮，王立金，沐林林，王文娟，宋佩佩，翟長平，何 震

精神分裂癥斷裂基因1(DSC1)是目前較明確的精神分裂癥易感基因之一，其首次在一個具有染色體平衡易位的蘇格蘭精神疾病高發(fā)家系中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究[1]顯示，DISC1與精神分裂癥存在明顯相關關系。精神分裂癥的遺傳模式復雜，難以用單純的遺傳因素來解釋，目前認為可能是遺傳因素和環(huán)境因素兩者相互作用共同導致了精神分裂癥的發(fā)生，表觀遺傳學解釋了在不改變基因型的情況下環(huán)境因素是如何致病的。微小RNA(miRNA)作為表觀遺傳學的一員，可以靶向結合目標mRNA負性調控眾多基因。精神分裂癥關聯(lián)的miRNA中，miRNA-181b表達和調控的異常與精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展的密切關聯(lián)已有報道[2-4]。miRNA-181b可能通過抑制DISC1基因及其蛋白的表達，影響突觸和神經(jīng)元的發(fā)育，在精神分裂癥的發(fā)病過程中起重要作用。本研究擬通過生物信息學分析精神分裂癥病人差異表達miRNA-181b-5p與精神分裂癥易感基因DISC1的結合位點，選取包含結合位點在內的上下游200 bp長度序列DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)人工合成目的基因，將合成的目的基因導入H343 pmirGLO空載體構建pmirGLO-DISC1 3′UTR，對構建的重組質粒進行分析和鑒定，以期為miRNA-181b-5p調控精神分裂癥易感基因DISC1的機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料 超微量分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司，K5600型)，PCR儀(Applied Biosystems，2720 thermal cycler)，凝膠成像分析儀(培清科技，JS-680D型)，DNA電泳槽(上海天能科技有限公司，HE-120型)。

H343 pmirGLO質粒和DH5α感受態(tài)細胞及和元無縫克隆試劑盒來自和元生物技術(上海)股份有限公司，AxyPrep質粒DNA小量抽提試劑盒來自愛思進生物技術(杭州)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成 通過生物信息學分析精神分裂癥病人差異表達miRNA-181b-5p與精神分裂癥易感基因DISC1的結合位點，TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測到2個結合位點(見圖1)，選取包含結合位點在內的上下游200 bp長度序列DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)人工合成目的基因。

1.2.2 制備線性化表達載體 在限制性內切酶的作用下酶切表達載體，酶切反應體系如下：2 μg質粒，10×反應Buffer 5 μL和1 μL限制性內切酶，用純水稀釋至50 μL，然后在37 ℃水浴鍋中孵育2 h以上。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物的酶切效果，并從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中切割出目的載體條帶，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0對切割的條帶進行回收。

1.2.3 目的基因構建入線性化表達載體 將目的基因片段和線性化載體按照2∶1比例添加到離心管中，在無縫克隆試劑盒作用下進行重組反應30 min，將反應后的產物轉移到冰上冷卻5 min。反應產物可以直接用于轉化，也可冷藏于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 轉化和PCR鑒定 (1)取具有抗生素抗性的質粒2 μL放入100 μL DH5α感受態(tài)細胞中，將上述混合液放在冰上冷卻30 min；(2)將混合液在42 ℃環(huán)境下熱激90 s后,立即放置在冰上，冷卻2 min；(3)加入1 mL LB液體培養(yǎng)基至管中，37 ℃、200 r/min 30min，活化細菌；(4)取50 mL菌液涂平板(如果轉化效率低，可多取菌液或離心棄上清取下層涂板；涂菌棒在酒精燈上烘烤之后應擱置稍涼后再涂板，以防殺死細胞)，涂板時，感受態(tài)涂兩個，有抗性，無抗性，轉化后菌液涂一個有抗性(涂板后的平板先正放一會，干燥菌液后將其倒置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng))；(5)選取平板上培養(yǎng)出的轉化子，將其重懸于10 μL LB培養(yǎng)液中，從中選取1 μL模板進行菌落PCR鑒定。

1.2.5 陽性克隆鑒定和質粒小提 菌落鑒定得到的陽性克隆，送樣本到和元生物技術(上海)股份有限公司進行測序驗證，比對測序結果并分析，測序通過的陽性克隆，采用AxyPrep質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒。

2 結果

2.1 pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒圖譜 以“Luc2-C-F GTG GTG TTG TGT TCG TGG AC”為正向測序引物，“SV40pA-F GCA ATA GCA TCA CAA ATT TC”為反向測序引物，Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ分別為上下游克隆酶切位點，H343 pmirGLO為空載體，將合成的目的基因DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)置于空載體中，構建pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒(見圖2)。

2.2 測序結果在NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫中的比較和分析 將pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒的克隆序列與NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫中的DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)序列分別推導出來的開放閱讀框進行比對(dnaman1：送測序的pmirGLO-DISC1 3′UTR質?？寺⌒蛄械拈_放閱讀框；dnaman2：NCBI數(shù)據(jù)庫中DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)序列的開放閱讀框)，結果表明：檢測序列與目標序列的覆蓋度為84%，相似度為100%。

2.3 pmirGLO-DISC13′UTR質粒的鑒定 將構建的pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒進行測序，結果與預期一致，部分測序法結果見圖3。

3 討論

DISC1基因與精神分裂癥的關聯(lián)最初是在蘇格蘭家系報道，此后在德國[5]、芬蘭[6]、中國[2-3]等地區(qū)人群的相關研究也證實了DISC1基因與精神分裂癥的發(fā)病存在一定的關聯(lián)。國外有研究[6]發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥病人的快感缺乏癥狀與DISC1基因有關聯(lián)。進一步研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，無論是在發(fā)育早期還是青春期后的大腦中，DISC1對突觸的形成和神經(jīng)元發(fā)育均有重要調控作用，DISC1基因和DISC1蛋白在早期神經(jīng)發(fā)育和成年后海馬神經(jīng)發(fā)過程中扮演著重要的角色，與精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展有關。精神分裂癥的遺傳模式復雜，單卵雙生子擁有一致的基因型，但精神分裂癥的同病率只有50%左右[10]，目前認為基因和環(huán)境的相互作用影響了精神分裂癥的病理生理過程。表觀遺傳學作為一種非傳統(tǒng)的遺傳模式，解釋了基因型不變的情況下環(huán)境因素是如何致病的。

miRNA憑借其在轉錄后水平對基因表達的調控，可以靶向調控大腦的分化和發(fā)育過程中的多個基因，對神經(jīng)突的形成、保持和生長等過程也有重要的調控作用[4]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥病人體內miRNA的差異表達與精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展有關聯(lián)。精神分裂癥關聯(lián)的miRNA中，miRNA-181b表達和調控的異常與精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展的密切關聯(lián)已有報道[2-4]。2008年BEVERIDGE等[12]選取21組病例和對照，利用基因芯片和實時定量PCR發(fā)現(xiàn)，miRNA-181b在精神分裂癥病人顳上回和背外側前額葉區(qū)中表達上調，進一步分析發(fā)現(xiàn)miRNA-181b可以靶向調控精神分裂癥的易感基因VSNL1[13]和AMPA[14]。2017年LIU等[15]檢索1990-2016年發(fā)表的有關精神分裂癥miRNA的文章，篩選出6篇合計330例精神分裂癥病人和202名健康對照者進行分析，也進一步證實了miRNA-181b在精神分裂癥病人外周血中高表達，對精神分裂癥具有較高的診敏感度和特異度。由此可見，miRNA-181b的差異表達可能在精神分裂癥的病理生理過程中起重要作用，但關于miRNA-181b在精神分裂癥發(fā)病中的機制暫無具體報道。

本研究運用TargetScan預測和分析hsa-miRNA-181b-5p(miRNA-181b的成熟體)的靶基因發(fā)現(xiàn)，hsa-miRNA-181b-5p可以靶向作用于DISC1，DISC1的3′UTR區(qū)有2個hsa-miRNA-181b-5p的結合位點，選取包含結合位點在內的上下游200 bp長度序列DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)人工合成了目的基因。以H343 pmirGLO為空載體，將合成的目的基因DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)置于空載體中，成功構建了pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒。將pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒的克隆序列與NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫中的DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，檢測序列與目標序列的覆蓋度為84%，相似度為100%，進一步對構建的pmirGLO-DISC1 3′UTR質粒進行測序，結果與預期一致。由此可見，本研究成功構建了精神分裂癥易感基因DISC1重組質粒pmirGLO-DISC1 3′UTR，為miRNA-181b-5p調控精神分裂癥易感基因DISC1奠定了基礎，可以用于后續(xù)研究。