馮 姍， 徐文麗， 吳濟(jì)民， 王 蕊， 趙明明， 曹 寧， 陳顯達(dá)，王帥星， 張 咪， 谷慧君， 張幼怡， 肖 晗△（北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科血管醫(yī)學(xué)研究所，國家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 009；石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 83000）

在病理?xiàng)l件下，心肌間質(zhì)出現(xiàn)膠原過度沉積，引起心臟纖維化。心臟纖維化是多種心血管疾病的共同特征，并最終導(dǎo)致心力衰竭。心臟中成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CFs）向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是心臟纖維化的重要病理過程［1］，已成為治療心血管疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是篩選抑制CFs 轉(zhuǎn)分化藥物的實(shí)驗(yàn)條件尚未經(jīng)系統(tǒng)地評(píng)估和優(yōu)化，是影響實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和可重復(fù)性的關(guān)鍵因素。在轉(zhuǎn)分化后，肌成纖維細(xì)胞高表達(dá)特征性的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），同時(shí)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)［2-4］，從而促進(jìn)心臟纖維化［5-7］。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）是促進(jìn)CFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的重要因素［8］，因此廣泛應(yīng)用于構(gòu)建體外誘導(dǎo)CFs 轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞模型。目前心臟CFs 轉(zhuǎn)分化的相關(guān)研究選擇的細(xì)胞代數(shù)有第1 代（passage 1，P1）、P2、P3 等，選擇的Ang II 刺激時(shí)程有24 和48 h等，細(xì)胞培養(yǎng)液血清濃度有0%、1%、10% 等［9-13］。本研究擬評(píng)估和比較Ang II 引起CFs 轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)條件，為實(shí)驗(yàn)研究體系的規(guī)范化提供數(shù)據(jù)支持。

材料和方法

1 動(dòng)物

新生（1～2日齡）和8周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～24 g，均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006，用于分離成年小鼠（4 只/10 cm 皿）和新生小鼠（40 只/10 cm 皿）CFs。動(dòng)物飼養(yǎng)和使用均完全遵照北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理標(biāo)準(zhǔn)。本研究已獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理分會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為LA2018112。

2 主要試劑

Ang II 購自Sigma-Aldrich；膠原酶Ⅱ和DMEM 培養(yǎng)液購自Gibco；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；Trizol、Hoechest 33342 和Alexa Fluor 488 偶聯(lián)的熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；抗α-SMA、I 型膠原（collagen type I，Col I）和纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體購自Abcam；抗GAPDH 抗體購自Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG（H+L）抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Neonatal Heart Dissociation Kit購自Miltenyi Biotec。

3 主要方法

3.1 成年小鼠CFs 的分離與培養(yǎng)取8 周齡雄性C57BL/6小鼠，斷頸后用乙醇消毒，剪開胸腔，取出心臟，修剪去除心耳和主動(dòng)脈，置于預(yù)冷的PBS 中。將心臟剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 的糜狀，加入5 mL 的0.1% 膠原酶Ⅱ并置于轉(zhuǎn)速為120 r/min 的恒溫磁力攪拌器中，37 ℃恒溫消化8 min。小心吸走上清，加入膠原酶，重復(fù)8～10 次上述過程，直至心臟消化完全。從第2 次消化開始，取上清加入等體積完全培養(yǎng)液，混合均勻。細(xì)胞懸液以室溫轉(zhuǎn)速200×g離心5 min，用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)貼壁的CFs 為原代細(xì)胞。采用免疫熒光法檢測波形蛋白（vimentin）以鑒定CFs。

3.2 新生小鼠CFs 的分離與培養(yǎng)采用Neonatal Heart Dissociation Kit 進(jìn)行分離。步驟如下：取40 只1～2 d 小鼠心臟，剪掉心臟上的血管組織，在預(yù)冷的平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）中沖洗2 遍，用剪刀把心臟組織剪碎并放入含有酶液的組織解離管中，利用Gentle MACS Octo Dissociator儀器消化心臟；消化結(jié)束后立即用完全培養(yǎng)液終止消化，70 μm 濾網(wǎng)過濾，200×g離心5 min，棄上清，使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，200×g離心5 min。用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，進(jìn)行差速貼壁，去除未貼壁細(xì)胞，已貼壁為原代的CFs。用免疫熒光法檢測vimentin對(duì)CFs進(jìn)行鑒定。

3.3 細(xì)胞傳代成年小鼠和新生小鼠CFs 生長至匯合度達(dá)90% 時(shí)，用1 mL 2.5 g/L 的胰蛋白酶37 ℃消化1 min 至細(xì)胞變圓，棄酶液，加入3 mL 完全培養(yǎng)液終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1.6×106接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.4 實(shí)驗(yàn)分組CFs 傳代至不同細(xì)胞代數(shù)（P1～P4），用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜后，更換為含不同濃度（0%、2% 和5%）胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)或加入終濃度為10?6mol/L的Ang II繼續(xù)培養(yǎng)，分別記為對(duì)照（control，Ctrl）組和Ang II組，24或48 h后收集樣品進(jìn)行檢測。

3.5 Western blot提取各組細(xì)胞樣品，使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）測定樣品中蛋白濃度，取相同質(zhì)量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。用TBST 緩沖液配制的5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，分別加入Ⅰ抗［α-SMA（1∶20 000）、Col I（1∶1 000）、FN（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）］4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入山羊抗兔的Ⅱ抗（稀釋比例分別為1∶40 000、1∶2 000、1∶2 000和1∶20 000）室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，每次10 min。使用GeneSys ECL 化學(xué)發(fā)光法系統(tǒng)成像。用ImageJ 圖像分析軟件測量灰度值，采用目的蛋白/GAPDH灰度值比值來計(jì)算蛋白的表達(dá)水平。

3.6 固定細(xì)胞免疫熒光技術(shù)棄掉培養(yǎng)液用PBS洗滌后加入4% 多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3次，每次5 min。用0.1% 的TritonX-100 室溫破膜10 min，再用PBS洗3次，每次5 min。用1% 牛血清白蛋白室溫封閉30 min 后加PBS 稀釋的Ⅰ抗（1∶100）4 ℃孵育過夜。用PBS洗3次，每次5 min后，加入PBS稀釋的Alexa Fluor 488偶聯(lián)的熒光Ⅱ抗（1∶200）室溫避光孵育1 h。PBS 洗3 次，每次5 min，Hoechst 33342染細(xì)胞核6 min。利用Array Scan 高內(nèi)涵系統(tǒng)采集各通道熒光，并分析熒光強(qiáng)度。

3.7 qPCR用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的RNA，采用Promega 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后使用Bio-Rad CFX96 Touch進(jìn)行qPCR（1 μg RNA）檢測。以GAPDH 為內(nèi)參照，通過2?ΔΔCt法比較目的基因的表達(dá)差異。引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成年小鼠CFs不同代數(shù)比較，P1成年小鼠CFs在Ang II刺激后轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物表達(dá)顯著增加

成年小鼠CFs傳代的處理流程及鑒定如圖1A、B所示。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，僅P1 成年小鼠CFs接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 的平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P<0.05）；處于P2～P4 的CFs 中α-SMA、Col I 和FN 平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比均無顯著變化（P>0.05），見圖1C。qPCR和Western blot 結(jié)果同樣顯示，僅P1 CFs 接受Ang II刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 表達(dá)水平顯著上升（P<0.05），見圖1D、E。且隨著代數(shù)增加，基礎(chǔ)狀態(tài)下，P4 CFs中α-SMA 和Col I平均熒光強(qiáng)度（圖1C）和表達(dá)水平（圖1D）較P1 CFs顯著上升。

2 新生小鼠CFs不同代數(shù)比較，P1新生小鼠CFs在Ang II刺激后，轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物表達(dá)顯著增加

新生小鼠CFs傳代的處理流程及鑒定如圖2A、B所示。與成年小鼠類似，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，僅P1 新生小鼠CFs 接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 的平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P<0.05）；處于P2～P4 的CFs 中α-SMA、Col I 和FN 平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比均無顯著變化（P>0.05），見圖2C。qPCR 和Western blot 結(jié)果也顯示，僅P1 CFs接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 表達(dá)水平顯著上升（P<0.05），見圖2D、E。且隨著代數(shù)增加，基礎(chǔ)狀態(tài)下，P4 CFs 中α-SMA、Col I和FN 表達(dá)水平較P1 CFs顯著上升，見圖2D。

3 Ang II 刺激成年小鼠CFs 不同時(shí)程比較，Ang II分別刺激24和48 h均可引起成年小鼠CFs轉(zhuǎn)分化

成年小鼠CFs細(xì)胞的處理如圖3A所示。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，Ang II 分別處理24 和48 h 后，P1 CFs 中α-SMA、Col I 和FN 的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比 均顯 著增 強(qiáng)（P<0.05），見 圖3B。 qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，P1 CFs 給予Ang II 刺激24 和48 h，細(xì)胞中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均顯著升高（P<0.05），見圖3C、D。

Figure 1.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts in different passages（P1 to P4）induced by Ang II for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：vimentin in adult mouse cardiac fibroblasts observed by immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）；C：immunofluorescence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；D：the mRNA expression of α-SMA, Col I and FN detected by qPCR；E：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs Ctrl（P1）group.圖1 成年小鼠成纖維細(xì)胞不同代數(shù)（P1～P4）給予Ang II刺激48 h后的轉(zhuǎn)分化情況

Figure 2.Transdifferentiation of neonatal mouse cardiac fibroblasts in different passages（P1 to P4）induced by Ang II for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：vimentin in neonatal mouse cardiac fibroblasts observed by immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）；C：immunofluorescence staining（scale bar =25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；D：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；E：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（P1）group.圖2 新生小鼠成纖維細(xì)胞不同代數(shù)（P1～P4）給予Ang II刺激48 h后的轉(zhuǎn)分化情況

4 Ang II 刺激新生小鼠CFs 不同時(shí)程比較，Ang II刺激48 h可引起P1新生小鼠CFs轉(zhuǎn)分化

新生小鼠CFs細(xì)胞的處理如圖4A所示。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，Ang II處理24和48 h后，P1新生小鼠CFs中α-SMA 和Col I的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比均顯著增強(qiáng)（P<0.05），但FN的平均熒光強(qiáng)度僅在刺激48 h 后顯著增強(qiáng)，見圖4B。qPCR 和Western blot 結(jié)果均顯示，Ang II 處理24 和48 h 后，P1 CFs 中α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均顯著上升（P<0.01），但Col I 和FN 的表達(dá)水平僅在刺激48 h后顯著升高，見圖4C、D。

5 比較不同血清濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)成年小鼠CFs，在含0% 和2% FBS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，CFs 受Ang II 刺激后轉(zhuǎn)分化更顯著

成年小鼠CFs細(xì)胞的處理如圖5A所示。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在含0% 和2% FBS 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，P1 CFs接受Ang II刺激48 h后，其α-SMA、Col I和FN的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比均顯著增強(qiáng)（P<0.05），見圖5B。qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，這些標(biāo)志物的mRNA 和蛋白水平變化與免疫熒光的結(jié)果一致，見圖5C、D。值得注意的是，在無Ang II刺激情況下，5% FBS 培養(yǎng)液與0% FBS 培養(yǎng)液相比，CFs中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 表達(dá)水平均顯著升高，見圖5C。

6 比較不同血清濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)新生小鼠CFs，在含0% 和2% FBS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，CFs 受Ang II 刺激后轉(zhuǎn)分化更顯著

新生小鼠CFs細(xì)胞的處理如圖6A所示。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，分別在含0% 和2% FBS 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，P1 新生小鼠CFs 接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I和FN 的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)（P<0.05）；在含5% FBS 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，CFs中α-SMA、Col I和FN的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比無顯著差異，見圖6B。qPCR 和Western blot結(jié)果呈現(xiàn)了一致的變化趨勢，見圖6C、D。同樣在無Ang II刺激情況下，5% FBS 培養(yǎng)液與0% FBS 培養(yǎng)液相比，CFs中α-SMA、Col I和FN的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，見圖6C。

討 論

本研究對(duì)成年小鼠和新生小鼠CFs 轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明成年小鼠CFs 最適宜的實(shí)驗(yàn)條件為：P1，含0%或2% FBS的培養(yǎng)液，Ang II刺激24 或48 h；新生小鼠CFs 最適宜的實(shí)驗(yàn)條件為：P1，含0%或2% FBS的培養(yǎng)液，Ang II刺激48 h。

CFs具有強(qiáng)大的分化潛能，增殖能力強(qiáng)且代謝旺盛，可體外培養(yǎng)、多次傳代［14-17］。有研究提出，當(dāng)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，與P0 的大鼠CFs 相比，P1～P3 細(xì)胞的大小顯著增加，細(xì)胞中的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、vimentin、前列腺素和Col I表達(dá)水平顯著升高，大鼠CFs 隨著傳代數(shù)的增加，肌成纖維細(xì)胞的含量增多［18-19］。本研究利用Ang II 在不同細(xì)胞代數(shù)情況下刺激成年小鼠和新生小鼠的CFs，結(jié)果顯示P1 成年小鼠和新生小鼠CFs 在接受Ang II 刺激48 h 后均可出現(xiàn)顯著轉(zhuǎn)分化，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，成年小鼠和新生小鼠CFs 自身也可以出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致Ang II無法進(jìn)一步誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化。

據(jù)報(bào)道，用Ang II 刺激成年小鼠和新生小鼠CFs 24 h 可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA 的表達(dá)，刺激至48 h 時(shí)，表達(dá)水平持續(xù)上升［20］。本研究使用Ang II 刺激P1 成年小鼠CFs 24 或48 h，刺激P1 新生小鼠CFs 48 h，均可出現(xiàn)顯著的轉(zhuǎn)分化。在Ang II 刺激P1 新生小鼠CFs 24 h 時(shí)，僅轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA 的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Col I和FN 的表達(dá)無顯著差異。結(jié)合之前的研究，我們推斷在Ang II 刺激P1 新生小鼠CFs 24 h 時(shí)，可能由于刺激時(shí)間較短，不足以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)分化導(dǎo)致構(gòu)建模型不穩(wěn)定。所以，使用Ang II 構(gòu)建成年小鼠細(xì)胞模型時(shí)，刺激時(shí)程24 和48 h 均適用；而構(gòu)建新生小鼠細(xì)胞模型時(shí)，選擇48 h更合適。

FBS 是一種含有細(xì)胞生長和維持所需營養(yǎng)物質(zhì)的復(fù)合物［21］。研究顯示，F(xiàn)BS 以劑量依賴的方式激活小鼠CFs中TGF-β1信號(hào)通路，促進(jìn)CFs轉(zhuǎn)分化［22］。本研究對(duì)在含0% FBS、2% FBS 和5% FBS 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的成年小鼠和新生小鼠CFs 給予Ang II 刺激48 h 后，觀察成年小鼠和新生小鼠CFs 僅在含0% 和2% FBS 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)分化。我們的結(jié)果還顯示，在無Ang II 刺激情況下，5% FBS 培養(yǎng)液與0% FBS 培養(yǎng)液相比，CFs 中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 表達(dá)水平均顯著升高。因此，我們推斷導(dǎo)致上述差異的原因可能是在高血清狀態(tài)下，血清會(huì)促進(jìn)CFs轉(zhuǎn)分化導(dǎo)致Ang II無法進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，過高的血清濃度均會(huì)影響成年小鼠和新生小鼠CFs的轉(zhuǎn)分化。

Figure 3.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts after Ang II stimulation for 24 and 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluorescence staining（scale bar =25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（24 h）group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ctrl（48 h）group.圖3 成年小鼠成纖維細(xì)胞在Ang II刺激24和48 h后的轉(zhuǎn)分化情況

Figure 5.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts in media containing different concentrations（0%，2% and 5%）of fe?tal bovine serum（FBS）after Ang II stimulation for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluores?cence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（0% FBS）group；*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（2% FBS）group.圖5 成年小鼠成纖維細(xì)胞在不同血清濃度（0%、2%和5%）培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，給予Ang II刺激48 h后的轉(zhuǎn)分化情況

Figure 6.Transdifferentiation of neonatal mouse cardiac fibroblasts in media containing different concentrations（0%，2% and 5%）of fetal bovine serum（FBS）after Ang II stimulation for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluores?cence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（0% FBS）group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ctrl（2% FBS）group.圖6 新生小鼠成纖維細(xì)胞在不同血清濃度（0%、2%和5%）培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，給予Ang II刺激48 h后的轉(zhuǎn)分化情況

綜上所述，本研究進(jìn)一步優(yōu)化Ang II 誘導(dǎo)的CFs轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)條件，主要通過對(duì)成年小鼠和新生小鼠CFs 的不同代數(shù)、不同處理時(shí)程和不同血清濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)進(jìn)行評(píng)估，顯示在含0% 或2%FBS 的培養(yǎng)液中用Ang II 刺激P1 成年小鼠24 或48 h均可以出現(xiàn)顯著的轉(zhuǎn)分化，在含0% 或2% FBS 的培養(yǎng)液中用Ang II刺激P1新生小鼠48 h可以出現(xiàn)顯著的轉(zhuǎn)分化。以上分別是CFs轉(zhuǎn)分化成年小鼠/新生小鼠細(xì)胞模型的較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件。本研究將為后續(xù)對(duì)于心臟纖維化的相關(guān)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。