陳集業(yè)， 廖英強(qiáng)， 黃 帥， 陳博豐， 劉興漠△

（1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510655；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510260）

前列腺癌作為全世界男性最為常見的惡性腫瘤之一［1］，在美國發(fā)病率高居首位，死亡率位居第二［2］，近年來多種因素導(dǎo)致其發(fā)病率在我國也呈現(xiàn)逐漸上升趨勢［3］。骨轉(zhuǎn)移在前列腺癌轉(zhuǎn)移中為最常見，也是造成患者死亡的主要原因，目前其治療方法仍是臨床需要攻克的難題之一［4-6］。腫瘤細(xì)胞的能量生成源自于糖酵解和線粒體的氧化磷酸化，研究表明，即使在有氧的情況下，腫瘤細(xì)胞仍選擇糖酵解方式而不是氧化磷酸化來提供能量，即有氧糖酵解或War?burg 效應(yīng)［7］。鑒于腫瘤細(xì)胞這種獨(dú)特的能量代謝方式，我們猜測抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移糖酵解途徑很可能成為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移治療的新策略。

紫檀芪（pterostilbene，PTE）是一種廣泛存在于葡萄、藍(lán)莓和花生等天然植物中的多酚化合物，現(xiàn)有證據(jù)發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中具有抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制需進(jìn)一步探討［8］。既往有研究發(fā)現(xiàn)PTE的類似物白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解、降低能量生成從而抑制腫瘤生長［9］，但PTE在前列腺癌細(xì)胞糖酵解中的具體作用尚不明確。本研究擬探討PTE 對人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3 細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和能量代謝的影響，為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移藥物治療提供一種新的思路。

材料和方法

1 材料

人前列腺癌PC-3 細(xì)胞株（ATCC）；胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（HyClone）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PTE、ATP 測定試劑盒、乳酸測定試劑盒和葡萄糖檢測試劑盒（Sig?ma）；兔抗人乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）、AMP 活化蛋白激酶（AMP-activatied protein kinase，AMPK）、Bad、Bax和Bcl-2抗體（Abcam）。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC-3 細(xì)胞用RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（含10% 胎牛血清）于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換培養(yǎng)液，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

3 方法

3.1 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力取PC-3 細(xì)胞以每孔1.0×104個細(xì)胞密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后，用含不同濃度（5、10、20、40 和80 μmol/L）PTE 的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，各濃度均設(shè)3平行孔，另設(shè)不加藥的空白對照孔。每孔中加入10 μL CCK-8溶液，5%CO2、37℃避光孵育4 h后，在酶標(biāo)儀450 nm 波長處讀取并記錄吸光度（A）。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% inhibitiory concentration，IC50）為30 μmol/L，并用該濃度的PTE處理PC-3 細(xì)胞不同時(shí)間（0、24、48 和72 h）后，用同樣的方法測定各A值。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期取PC-3 細(xì)胞以每孔1.0×104的密度接種于6 孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱過夜后，加入20 和40 μmol/L 的PTE 繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，每個濃度均設(shè)3 個平行孔，對照組加入同體積的PBS。分別將收集到的各組細(xì)胞離心，PBS 洗滌，70% 乙醇固定，4 ℃下保存過夜，次日再次離心及PBS 重懸細(xì)胞，加入PI-Rnase A 混合液，室溫避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期情況。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取PC-3 細(xì)胞以每孔1.0×104的密度接種于6孔板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱過夜后，加入20和40 μmol/L的PTE繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，每個濃度均設(shè)3個平行孔，對照組加入同體積的PBS。將收集到的各組細(xì)胞用PBS 洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×109/L，加入Annexin V-PI 混合液，室溫避光孵育15 min 后，用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡情況。

3.4 葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)生和ATP產(chǎn)生的檢測分別用20 和40 μmol/L 的PTE 處理PC-3 細(xì)胞48 h，每個濃度均設(shè)3 個平行孔，另設(shè)新鮮培養(yǎng)基作為對照組，收集上清液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用葡萄糖檢測試劑盒測量葡萄糖攝取量，乳酸測定試劑盒測量乳酸生成量，ATP測定試劑盒測量ATP水平。

3.5 Western blot 法檢測Bad、Bax、Bcl-2、LDHA 和AMPK 表達(dá)分別用20和40 μmol/L 的PTE 處理PC-3 細(xì)胞48 h 后，裂解細(xì)胞、提取蛋白。按BCA 法檢測細(xì)胞總蛋白的濃度。蛋白上樣（每孔60 μg），經(jīng)12%SDS-PAGE 將蛋白進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。加入5% 的脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h。TBST 洗膜5 次，每次3 min，加入Ⅰ抗（兔抗人LDHA 和AMPK 抗體，1∶2 000；兔抗人Bad、Bax、Bcl-2和內(nèi)參照GAPDH抗體，1∶1 000），4 ℃反應(yīng)過夜。次日再次TBST 洗膜5 次，每次3 min。加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫反應(yīng)1.5 h。再用TBST 緩沖液洗膜5 次，每次3 min。ECL 試劑盒顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件處理。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度的PTE對PC-3細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，20、40 和80 μmol/L PTE 處理48 h 均可顯著抑制PC-3 細(xì)胞活力（P<0.05 或P<0.01）；PTE的IC50約為30 μmol/L，見圖1。

2 PTE不同處理時(shí)間對PC-3細(xì)胞活力的影響

隨著30 μmol/L PTE 作用時(shí)間（0、24、48 和72 h）的延長，其對PC-3 細(xì)胞活力的抑制作用越來越顯著，且給藥48 和72 h 后抑制作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

Figure 2.Effects of pterostilbene（PTE）treatment for different time on the viability of PC-3 cells measured by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs DMSO group.圖2 紫檀芪不同處理時(shí)間對PC-3細(xì)胞活力的影響

3 PTE對PC-3細(xì)胞周期的影響

PTE 處理后PC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期被明顯阻滯在DNA 的合成期（S 期），而細(xì)胞靜止期及DNA 合成前期（G0/G1期）的細(xì)胞相對減少，并呈劑量依賴性（P<0.01）；與對照組相比，DNA 合成后期（G2期）和細(xì)胞分裂期（M 期）的細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 紫檀芪對PC-3細(xì)胞周期的影響Table 1.Effect of pterostilbene（PTE）on PC-3 cell cycle mea?sured by flow cytometry（%.Mean±SD. n=3）

4 PTE對PC-3細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)過48 h 處理后，20 和40 μmol/L 的PTE 可明顯促進(jìn)PC-3 細(xì)胞凋亡，并呈明顯的劑量依賴性，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 紫檀芪對PC-3細(xì)胞凋亡的影響Table 2.Effect of pterostilbene（PTE）on the apoptosis of PC-3 cells measured by flow cytometry（%.Mean±SD. n=3）

5 PTE對PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，20 和40 μmol/L 的PTE 可上調(diào)PC-3細(xì)胞中的促凋亡蛋白Bad和Bax的表達(dá)，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 水平的表達(dá)，并呈劑量依賴性（P<0.01），見圖3。

6 PTE對PC-3細(xì)胞能量代謝的影響

與對照組相比，20 和40 μmol/L 的PTE 均可降低PC-3 細(xì)胞中的葡萄糖攝取量以及乳酸產(chǎn)生水平（P<0.01），且呈劑量依賴性；而與之相對應(yīng)的是，PC-3細(xì)胞中ATP 的生成趨勢隨著PTE 濃度的升高而逐漸下降（P<0.01），提示PTE 可抑制PC-3 細(xì)胞的有氧糖酵解，抑制腫瘤細(xì)胞的能量生成，見圖4。

7 PTE對PC-3細(xì)胞LDHA和AMPK表達(dá)的影響

與對照組相比，20 和40 μmol/L 的PTE 處理可抑制PC-3 細(xì)胞中的LDHA 及AMPK 的表達(dá)水平，且隨著PTE濃度的升高，降低越明顯（P<0.01），見圖5。

討 論

Figure 3.Effect of pterostilbene（PTE）on the expression of apoptosis-related proteins .Western blot was used to detect the expres?sion of Bad，Bax and Bcl-2 in PC-3 cells cultured with different concentrations of PTE，and Image-Pro Plus software was used to analyze the gray value of protein bands.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol/L group.圖3 紫檀芪影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

Figure 4.Effects of different concentrations of pterostilbene（PTE）on energy metabolism of PC-3 cells.The glucose uptake，lactic acid production and ATP level were measured by glucose detection kit，lactic acid determination kit and ATP assay kit，re?spectively.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol/L group.圖4 不同濃度紫檀芪對PC-3細(xì)胞能量代謝的影響

Figure 5.Effects of different concentrations of pterostilbene（PTE）on the expression of LDHA and AMPK in PC-3 cells.Western blot was used to detect the expression of AMPK and LDHA in PC-3 cells cultured with different concentrations of PTE，and Image-Pro Plus software was used to analyze the gray value of protein bands.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol/L group.圖5 不同濃度紫檀芪對PC-3細(xì)胞LDHA和AMPK表達(dá)的影響

前列腺癌骨轉(zhuǎn)移治療失敗的因素復(fù)雜多樣，而腫瘤的耐藥性是主要原因之一，故近年來許多學(xué)者均致力于探尋新的安全有效的抗腫瘤藥物，以期降低腫瘤的耐藥風(fēng)險(xiǎn)并提高前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的生存率。許多臨床前研究已證實(shí)一些天然植物化學(xué)物質(zhì)的抗腫瘤作用聯(lián)合癌癥的傳統(tǒng)化療方法具有相加或協(xié)同效應(yīng)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，PTE 作為一種天然植物化合物對多種腫瘤等均具有明顯抑制作用［11］。而在本研究中，我們證實(shí)了PTE 對人前列腺癌PC-3 細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用。

細(xì)胞周期的異?？蓪?dǎo)致腫瘤細(xì)胞進(jìn)行無限制地增殖，因此對細(xì)胞周期的調(diào)控被認(rèn)為是腫瘤治療中很有吸引力的途徑。研究發(fā)現(xiàn)PTE 可通過對細(xì)胞周期的阻滯抑制癌細(xì)胞的增殖。在研究PTE 對人膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）細(xì)胞的作用中發(fā)現(xiàn)，PTE 可以通過阻滯CCA 細(xì)胞的細(xì)胞周期于S 期從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［12］。而在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，PTE 是通過ERK 通路顯著延遲細(xì)胞周期至G0/G1期從而抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖［13］。本研究中，根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們證實(shí)了PTE 對PC-3 細(xì)胞的活力具有抑制作用，且該抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。此外，在檢測PTE 對PC-3 細(xì)胞的細(xì)胞周期影響的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期明顯被阻滯在DNA 合成期S 期，由此我們推測PTE 可能通過影響DNA 的復(fù)制過程來抑制PC-3 細(xì)胞的生長。此外，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTE 還可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長［14-15］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著PTE 濃度的增加，PC-3 細(xì)胞凋亡數(shù)目隨之增加，同時(shí)促進(jìn)凋亡的蛋白Bad 和Bax 表達(dá)相應(yīng)增加，而抑制凋亡的蛋白Bcl-2表達(dá)相應(yīng)減少，表明PTE 可呈劑量依賴性促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞的凋亡從而抑制腫瘤的發(fā)展。

腫瘤中有氧糖酵解增加的實(shí)驗(yàn)觀察已被反復(fù)證實(shí)。有氧糖酵解是在腫瘤細(xì)胞中觀察到的最具特征的代謝表型，與大多數(shù)正常細(xì)胞不同，即使在正常氧濃度下，腫瘤細(xì)胞也是主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP 以獲得大量能量，將大部分進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，從而為腫瘤發(fā)生發(fā)展提供足夠優(yōu)勢［16］。雖然糖酵解產(chǎn)生ATP 的速度比線粒體的氧化磷酸化更加快速，但就消耗每單位葡萄糖產(chǎn)生ATP 而言，它的效率要低得多。因此，這種轉(zhuǎn)變需要腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)異常高的葡萄糖攝取率，以滿足其增加的能量、生化合成以及氧化還原需求［17-18］。而諸多實(shí)驗(yàn)表明，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解，可明顯促進(jìn)細(xì)胞代謝能量的生成從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而糖酵解被抑制后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［19-21］。為確定PTE 對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的能量代謝的影響，我們測量了PTE 作用PC-3 細(xì)胞后其萄糖攝取量和細(xì)胞內(nèi)的乳酸生成量，結(jié)果顯示，PTE 可明顯抑制PC-3 細(xì)胞的葡萄糖攝取以及細(xì)胞內(nèi)的乳酸生成水平，同時(shí)相對應(yīng)的PC-3 細(xì)胞內(nèi)ATP 的生成量同樣呈下降趨勢，這說明PTE 可通過減少細(xì)胞的葡萄糖攝取、抑制糖酵解從而抑制PC-3細(xì)胞能量的產(chǎn)生。這與PTE對PC-3細(xì)胞活力的抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡情況一致，提示PTE 導(dǎo)致的PC-3 細(xì)胞的活力抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡與抑制細(xì)胞的能量產(chǎn)生有關(guān)。

LDHA上調(diào)已在許多類型的腫瘤中被報(bào)道，并與不良預(yù)后顯著相關(guān)［22-23］。LDHA 不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而且能促進(jìn)腫瘤在體內(nèi)外的生長［24］。在癌細(xì)胞的有氧糖酵解中，LDHA作為糖酵解過程的關(guān)鍵酶之一，將丙酮酸還原為乳酸，并產(chǎn)生少量ATP，從而維持腫瘤的高糖酵解率，即前述的War?burg 效應(yīng)。減少LDHA 的表達(dá)，丙酮酸無法還原為乳酸，腫瘤細(xì)胞依賴的糖酵解過程受到抑制，其增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲最終因能量來源限制而受到抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制LDHA 的表達(dá)可導(dǎo)致乳酸減少而腫瘤微環(huán)境酸化受到破壞，腫瘤細(xì)胞因此生長減少，凋亡增加，侵襲能力減弱，從而顯著減緩腫瘤的進(jìn)展［25］。而AMPK 是哺乳動物組織中細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)器。細(xì)胞能量狀態(tài)下降時(shí)可激活A(yù)MPK，活化的AMPK 將進(jìn)一步激活產(chǎn)生ATP的分解代謝途徑（如葡萄糖的攝取、糖酵解），同時(shí)下調(diào)消耗ATP 的生物合成途徑［26］。AMPK 的激活也可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝可塑性為癌細(xì)胞提供生長優(yōu)勢，從而為腫瘤細(xì)胞提供適應(yīng)能量代謝應(yīng)激的靈活性［27］。本研究中，隨著PTE 濃度的增加，LDHA 和AMPK 的表達(dá)逐漸下降，這與PC-3 細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取、乳酸及ATP 生成量的減少相印證，且與PC-3 細(xì)胞活力抑制、促細(xì)胞凋亡的趨勢一致，進(jìn)一步說明PTE 可能通過抑制PC-3 細(xì)胞糖酵解途徑、減少代謝能量的生成從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3 細(xì)胞的活力并促進(jìn)凋亡。

綜上所述，我們通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTE 可抑制前列腺癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)展，其作用可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解、減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)能量的生成而實(shí)現(xiàn)。但PTE 對腫瘤細(xì)胞能量代謝影響的深層機(jī)制、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是否與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致、聯(lián)合化療藥物的作用等這些仍需進(jìn)一步探討。