申 晗， 高冠論， 許艷麗， 張 星， 杜慶華， 李慶山，△

（1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2暨南大學(xué)附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510220；3華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510180）

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lym?phoma，DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），占發(fā)達(dá)國(guó)家成人NHL 的25%～35%，其按照細(xì)胞起源分為生發(fā)中心B 細(xì)胞樣（germinal center B-cell-like，GCB）亞型和非GCB 亞型［1-2］。R-CHOP［利妥昔單抗（rituximab，RTX）、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松］方案是DLBCL的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，大大改善了DLBCL 的治療效果［3］，但對(duì)非GCB 型DLBCL 的療效和整體預(yù)后仍差于GCB 型DLBCL［4］。在非GCB 型DLBCL 中，治療后總體復(fù)發(fā)率超過30%。一些難治/復(fù)發(fā)病例對(duì)RTX產(chǎn)生了耐藥性，這使得治療更加困難［5-6］。所以在RCHOP 方案的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他治療策略（即RCHOP+X）而增強(qiáng)RTX 敏感性是目前研究的熱點(diǎn)，這些策略包括聯(lián)合Bruton 酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）抑制劑、抗CD30藥物偶聯(lián)劑、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫檢查點(diǎn)阻斷劑和表觀遺傳學(xué)抑制劑等。

BTK 抑制劑伊布替尼是近10年來治療B 細(xì)胞淋巴瘤包括DLBCL 的重要新藥［7］，伊布替尼是第1 個(gè)小分子BTK 抑制劑，它抑制BTK 磷酸化，從而阻斷B細(xì)胞激活，在自身免疫性疾病和B 細(xì)胞惡性腫瘤模型中有效［8］。在DLBCL 患者中，二期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，伊布替尼對(duì)非GCB 型DLBCL 比GCB 型患者更有效?？赡艿?機(jī)制是非GCB 型DLBCL 比GCB 型DLBCL 更能持續(xù)激活B 細(xì)胞受體信號(hào)通路，從而使得伊布替尼發(fā)揮更大的作用［9］。但同時(shí)，伊布替尼還與其他激酶，例如表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth fac?tor receptor，EGFR）、肝細(xì)胞癌中表達(dá)的酪氨酸激酶、白細(xì)胞介素2誘導(dǎo)型T細(xì)胞激酶（interleukin-2-in?ducible T-cell kinase，ITK）和TXK 酪氨酸激酶不可逆地結(jié)合［10］，從而給其與RTX 的聯(lián)用帶來了負(fù)面效果。RTX 主要通過3 種途徑殺傷腫瘤細(xì)胞：（1）補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC），即與抗原結(jié)合的抗體激發(fā)補(bǔ)體形成膜攻復(fù)合物使細(xì)胞溶解，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白如CD55、CD59 的表達(dá)上調(diào)可抑制補(bǔ)體激活，從而導(dǎo)致CDC 作用減弱；（2）抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（antibody-depen?dent cell-mediated cytotoxicity，ADCC），即是一種由抗原抗體結(jié)合后，攜帶Fcγ 受體的細(xì)胞（如NK 細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T 細(xì)胞等）識(shí)別IgG 抗體的Fc 片段而引起的免疫殺傷效應(yīng)；（3）直接效應(yīng)，即RTX 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)的激活引起抗增殖作用或者細(xì)胞死亡［11］。而伊布替尼對(duì)ITK 的脫靶抑制會(huì)拮抗NK 細(xì)胞介導(dǎo)的抗CD20 抗體依賴的ADCC［12］。同時(shí)一項(xiàng)三期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于未經(jīng)治療的非GCB型DLBCL 患者，在R-CHOP 中加入伊布替尼并沒有改善療效［13］。

而阿卡替尼（acalabrutinib，Aca）是第二代、選擇性、不可逆的BTK 抑制劑，與伊布替尼最大的不同就是對(duì)靶點(diǎn)的選擇性，Aca 顯著減少了BTK 以外的脫靶效應(yīng)，例如EGFR、TEC 和ITK 等［14］，因而有可能會(huì)消除伊布替尼與RTX聯(lián)用時(shí)的不足。近期通過分析發(fā)現(xiàn)，作為RTX 原研藥美羅華（MabThera?）的生物類似藥，漢利康?（HLX01）在理化性質(zhì)和生物活性方面與其高度相似［15］，因此需要進(jìn)一步探索Aca 與RTX（HLX01）聯(lián)用對(duì)非GCB 型DLBCL 的效果?；诖?，我們希望進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)Aca 聯(lián)用RTX（HLX01）是否會(huì)增加對(duì)RTX（HLX01）耐藥的非GCB型DLBCL細(xì)胞株的殺傷效果及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，為Aca逆轉(zhuǎn)DLBCL 對(duì)靶向藥物的耐藥性提供更多的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞

人非GCB 型DLBCL 細(xì)胞株NU-DUL-1 購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，其耐藥株NU-DUL-1-R自行構(gòu)建，構(gòu)建方法見下文。所有實(shí)驗(yàn)均使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)的細(xì)胞；NU-DUL-1-R 是停藥1 周后恢復(fù)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)的細(xì)胞。

2 主要試劑

Aca 購(gòu)自Selleck；RTX（HLX01，漢利康?）購(gòu)自上海復(fù)宏漢霖生物制藥有限公司；FITC 標(biāo)記的抗人CD20、CD55 及CD59 抗體購(gòu)自BioLegend；羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl es?ter，CFSE）、PE-Cy7 標(biāo)記的抗人CD3 單抗和Percp-Cy5.5 標(biāo)記的抗人CD8 單抗購(gòu)自Tonbo Biosciences；APC-eFluor780 標(biāo)記的抗人白細(xì)胞介素17（interleu?kin-17，IL-17）單抗購(gòu)自Invitrogen；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購(gòu)自Dojindo。ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

3 方法

3.1 耐藥株的構(gòu)建和培養(yǎng)補(bǔ)體來源為從健康志愿者身上采集的新鮮外周血血清，通過RTX 的CDC作用誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞。耐藥細(xì)胞是將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的親本細(xì)胞體外培養(yǎng)于含20% 正常人新鮮血清（normal human serum，NHS）的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，從低濃度逐漸遞增加入RTX（1、2、4、8、16、32、64和128 mg/L）誘導(dǎo)構(gòu)建而成。

3.2 耐藥細(xì)胞株NU-DUL-1-R的生物學(xué)特性

3.2.1 生長(zhǎng)曲線收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)并稀釋成5×107/L 的細(xì)胞懸液。在96 孔板中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞（NU-DUL-1 和NU-DUL-1-R）各設(shè)定3 復(fù)孔，接種7 塊96 孔板。每天于相同時(shí)點(diǎn)向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，避光孵育4 h左右，并檢測(cè)吸光度（A）值，連續(xù)7 d，繪制出生長(zhǎng)曲線，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，每天的A值/0 h 的A值為縱坐標(biāo)。

3.2.2 細(xì)胞周期制備NU-DUL-1 或NU-DUL-1-R單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L。加入1 mL DNA staining solution 和10 μL permeabilization solu?tion 混勻后室溫下避光染色30 min。流式檢測(cè)時(shí)選擇最低上樣速度。用FlowJo 進(jìn)行細(xì)胞周期分析可以自動(dòng)識(shí)別出G1期、S 期和G2期各期細(xì)胞的占比。通過增殖指數(shù)（proliferation index，PI）表示細(xì)胞增殖狀況，公式為PI=（S+G2M）/（G0G1+S+G2M）。

3.2.3 死活染料7-氨基放線菌素D（7-aminoactino?mycin D，7-AAD）流式染色檢測(cè)耐藥株與親本株CDC 效應(yīng)的差異分別將NU-DUL-1和NU-DUL-1-R細(xì)胞重懸于含20% NHS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，以每孔1×106鋪在6 孔板中，根據(jù)加入RTX 的濃度不同分為3 組：0 mg/L、4 mg/L 和100 mg/L，處理2～4 h 后收集各組細(xì)胞，采用7-AAD 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NU-DUL-1 和NU-DUL-1-R 細(xì)胞對(duì)RTX 誘導(dǎo)的CDC作用的差異。

3.2.4 CFSE/7-AAD 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)耐藥株與親本株的ADCC 效應(yīng)用CFSE 標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，再將人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和腫瘤細(xì)胞以1∶1、5∶1、10∶1 和20∶1 的比例共培養(yǎng)于6孔板中，并加入RTX（終濃度為100 mg/L）處理24 h，采用7-AAD 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADCC效應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。

3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)耐藥株和親本株表面抗原CD20、CD55 及CD59 表達(dá)的變化收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，PBS 洗滌重懸后向細(xì)胞懸液中分別加入5 μL 的表面抗原CD20、CD55 及CD59 流式抗體，輕輕震蕩混勻，在室溫或者4 ℃下避光孵育20～30 min，洗滌重懸，然后流式上機(jī)檢測(cè)。

3.3 CCK-8法測(cè)定Aca對(duì)細(xì)胞增殖的影響將細(xì)胞按照每孔2×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，并分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的Aca 處理48 h，然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，避光孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔A值。

3.4 7-AAD 流式染色檢測(cè)CDC 效應(yīng)將NU-DUL-1-R 細(xì)胞重懸于含20% NHS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，以每孔1×106鋪在6 孔板中，分為6 組：對(duì)照（con?trol）組（加入相同體積的完全培養(yǎng)基）、單藥Aca（6 μmol/L）組、單藥Aca（12 μmol/L）組、單藥RTX 組、RTX+Aca（6 μmol/L）組和RTX+Aca（12 μmol/L）組。其中Aca 的濃度依據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)確定，RTX 的濃度是100 mg/L。Aca 處理48 h 后對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行換液處理，分別將每孔細(xì)胞重懸于含20% NHS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，按照不同分組加入RTX。RTX 處理細(xì)胞2～4 h 后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行7-AAD 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

3.5 CFSE/7-AAD 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADCC 效應(yīng)將NU-DUL-1-R 用CFSE 標(biāo)記后加入PBMCs 共培養(yǎng)，效靶比為5∶1。將NU-DUL-1-R+PBMCs 共培養(yǎng)的細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基中，以每孔2×106鋪在6孔板中，按照不同的處理方式分為6 組：control 組（加入相同體積的完全培養(yǎng)基）、單藥Aca（6 μmol/L）組、單藥Aca（12 μmol/L）組、單藥RTX 組、RTX+Aca（6 μmol/L）組和RTX+Aca（12 μmol/L）組。RTX 的濃度是100 mg/L。處理完成后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行7-AAD 染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Aca 聯(lián)合RTX 對(duì)Th17 細(xì)胞分化的影響將PBMCs 與NU-DUL-1-R 以5∶1 的比例共培養(yǎng)，并按照3.5 中分為6 組，處理完成后在培養(yǎng)基中加入50 μg/L 的佛波酯、1 mg/L 的離子霉素和10 mg/L 的Brefeldin A，刺激細(xì)胞5 h。然后按說明書要求加入PE-Cy5 標(biāo)記的抗人CD3 單抗和FITC 標(biāo)記的抗人CD8 單抗，室溫下避光孵育20 min，以標(biāo)記CD4+T細(xì)胞（CD3+CD8?T細(xì)胞）。用PBS洗滌，固定、破膜后，加入PE 標(biāo)記的抗人IL-17 單抗，室溫下避光孵育30 min。PBS 洗滌、重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。

3.7 ELISA法檢測(cè)Aca聯(lián)合RTX處理后培養(yǎng)上清液中IL-17 的濃度按上述方案進(jìn)行分組，處理完成后收集各組培養(yǎng)上清液，然后按照IL-17 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，用多功能微孔板分析儀測(cè)出各血清A值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出標(biāo)本中各IL-17 的濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有體外實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了至少3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，代表性結(jié)果顯示在圖中。GraphPad Prism 8 軟件繪圖，運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)；多組資料之間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NU-DUL-1-R細(xì)胞耐藥性檢測(cè)

1.1 RTX 對(duì)耐藥株與親本株CDC 及ADCC 效應(yīng)的差異對(duì)于CDC 作用，通過對(duì)RTX 對(duì)耐藥株和親本株的殺傷作用進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測(cè)結(jié)果顯示4 mg/L 和100 mg/L 的RTX 對(duì)NU-DUL-1-R 細(xì) 胞 的CDC 作用均比對(duì)NU-DUL-1 細(xì)胞弱（P<0.05），見圖1A。

同時(shí)對(duì)于ADCC 作用而言，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不論在何種效靶比之下，RTX 對(duì)NU-DUL-1-R 細(xì) 胞的ADCC 作用 都 比NU-DUL-1 細(xì) 胞 弱（P<0.05）；同時(shí)，效靶比為5∶1時(shí)的ADCC 作用與效靶比10∶1 及20∶1 時(shí)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇效靶比5∶1，見圖1B。

1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期和表面抗原表達(dá)的變化采用CCK-8 法檢測(cè)NU-DUL-1 和NU-DUL-1-R細(xì)胞每天的A值并繪制出生長(zhǎng)曲線，可以看出與親本細(xì)胞株NU-DUL-1 相比，耐藥細(xì)胞株NU-DUL-1-R生長(zhǎng)速度較慢，見圖2A。同時(shí)，對(duì)NU-DUL-1 和NUDUL-1-R 細(xì)胞采用流式細(xì)胞周期分析顯示，相較于親本細(xì)胞株，耐藥細(xì)胞株在G1期的細(xì)胞比例升高，在S 期和G2期的細(xì)胞比例略少，PI 顯著減?。≒<0.05），見圖2B。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述細(xì)胞株CD20、CD55及CD59 抗原表達(dá)情況，結(jié)果顯示耐藥株NU-DUL-1-R 與親本細(xì)胞株相比CD20 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），但CD55 和CD59 表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05），見圖2C。

2 不同濃度的Aca 對(duì)NU-DUL-1-R 細(xì)胞活力的影響

通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的Aca 對(duì)NUDUL-1-R 細(xì)胞活力的影響，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組給予Aca（2.5、5、10、20、40 和80 μmol/L）處理后，NUDUL-1-R 細(xì)胞活力均受到顯著抑制，且呈劑量依賴性，IC50=12.51 μmol/L，見圖3。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取IC50和1/2 IC50的近似值作為Aca 的處理濃度，即12 μmol/L和6 μmol/L。

3 Aca 聯(lián)合RTX 的CDC 效應(yīng)對(duì)NU-DUL-1-R 細(xì)胞殺傷的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Aca 聯(lián)合RTX 的CDC 效應(yīng)下NU-DUL-1-R 細(xì)胞的死亡率，結(jié)果顯示，與單藥組相比，Aca 與RTX 聯(lián)用組細(xì)胞死亡率均更高（P<0.01），說明兩藥聯(lián)用誘導(dǎo)的殺傷效果更強(qiáng)；同時(shí)，聯(lián)合作用組中殺傷效果也呈劑量依賴性，Aca 濃度增大，殺傷效果增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4A。

4 Aca 聯(lián)合RTX 的ADCC 效 應(yīng)對(duì)NU-DUL-1-R 細(xì)胞殺傷的影響

Figure 1.Death rates of NU-DUL-1 and NU-DUL-1-R cells induced by rituximab（RTX）.A：the complement-dependent cytotoxicity（CDC）of RTX detected by flow cytometry；B：the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity（ADCC）of RTX detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs NU-DUL-1 group.圖1 利妥昔單抗誘導(dǎo)的NU-DUL-1和NU-DUL-1-R細(xì)胞死亡率

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Aca 聯(lián)合RTX 的ADCC 效應(yīng)下NU-DUL-1-R 細(xì)胞的死亡率，結(jié)果顯示，與單藥組相比，聯(lián)用組比單藥組細(xì)胞死亡率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明兩藥物聯(lián)用誘導(dǎo)的ADCC 效果更強(qiáng)，見圖4B。

5 Aca 聯(lián)合RTX 對(duì)Th17 細(xì)胞分化及IL-17 分 泌的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，CD4+T 淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞所占比例約為2.5%，與對(duì)照組相比，Aca處理后Th17 細(xì)胞占CD4+T 淋巴細(xì)胞的比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)，RTX 處理后Th17 細(xì)胞占CD4+T 淋巴細(xì)胞的比例升高，而Aca 聯(lián)用RTX 處理后Th17 細(xì)胞比例比單藥RTX 組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5A。

ELISA 結(jié)果同樣顯示，相較于對(duì)照組，單藥Aca組的IL-17 分泌更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而單藥RTX 組的IL-17分泌最多，與之相比兩藥聯(lián)用組的IL-17分泌顯著減少（P<0.05），見圖5B。

討 論

RTX 是抗CD20 單克隆抗體，在DLBCL 治療中發(fā)揮著基石作用。一項(xiàng)三期、多中心、隨機(jī)、平行、雙盲研究證實(shí)了漢利康（HLX01）與美羅華之間的治療等效性［16］。同時(shí)，由于價(jià)格相對(duì)于美羅華來說更低，國(guó)產(chǎn)的仿制藥物如漢利康（HLX01）等在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，從而使得更多DLBCL 患者受益，但是對(duì)于RTX所產(chǎn)生的耐藥性是阻礙患者長(zhǎng)期生存的重要因素［17］，因此研究RTX（HLX01）的耐藥機(jī)制以及尋找增加RTX 的敏感性方法是目前急需解決的問題。

目前在R-CHOP 方案基礎(chǔ)上加上其他的策略（R-CHOP+X）為目前研究的熱點(diǎn)，其中BTK 抑制劑聯(lián)合R-CHOP 是新的研究熱點(diǎn)。BTK 抑制劑伊布替尼聯(lián)合RTX 本有望增強(qiáng)非GCB 型DLBCL 的治療效果，但是臨床研究未顯示出患者獲益，主要是由于伊布替尼對(duì)ITK 的脫靶抑制，從而拮抗了抗CD20 單抗介導(dǎo)的ADCC［12］。因此，Aca 作為第二代、選擇性更高的BTK 抑制劑［14］，成為了我們研究的新方向。而NU-DUL-1 細(xì)胞株作為來源于人的非GCB 型DLBCL細(xì)胞株，與GCB 型DLBCL 相比，其對(duì)RTX 的反應(yīng)和效果較差［18］，是進(jìn)行RTX 耐藥性相關(guān)研究的理想細(xì)胞模型。

Figure 2.The diversity in biological characteristics between NU-DUL-1 and NU-DUL-1-R cell lines.A：growth curve of the two cell lines；B：comparison of cell cycle between the two cell lines；C：cell surface antigen expression of the two cell lines.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs NU-DUL-1 group.圖2 NU-DUL-1和NU-DUL-1-R細(xì)胞株生物學(xué)特性差異

Figure 3.The viability of NU-DUL-1-R cells after treated with different concentrations of acalabrutinib （Aca） de?tected by CCK-8 method.Mean±SD. n=3.圖3 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度阿卡替尼處理后NU-DUL-1-R細(xì)胞的活力

惡性B細(xì)胞對(duì)RTX 耐藥的機(jī)制主要包括CDC效應(yīng)減弱、ADCC 作用減弱、直接凋亡作用減弱、CD20表達(dá)降低、CD20 構(gòu)象變化、腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用等［19］。其中，腫瘤細(xì)胞表面CD20 表達(dá)下調(diào)是其抗CD20 單克隆抗體抵抗最直接和常見的原因之一［20］。同時(shí)臨床也觀察到復(fù)發(fā)/難治型DLBCL 患者腫瘤細(xì)胞表面CD20表達(dá)下調(diào)［21］?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們參考相關(guān)文獻(xiàn)的耐藥株構(gòu)建方法［18，22］，誘導(dǎo)出了可耐受128 mg/L RTX 的耐藥細(xì)胞株NU-DUL-1-R，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出RTX 對(duì)NU-DUL-1-R 細(xì)胞的CDC作用和ADCC 作用均比親本株明顯減弱，且CD20 流式染色顯示其相對(duì)表達(dá)量顯著下降。但與王文廉等［23］的研究結(jié)果不同的是，NU-DUL-1 與NU-DUL-1-R 細(xì)胞表面的CD55 和CD59 表達(dá)無(wú)顯著差異，這可能與DLBCL的高度異質(zhì)性有關(guān)［24］。

除此之外，我們觀察到相較于親本株，耐藥株的生長(zhǎng)速度較慢，這與徐宗斌［25］等的研究結(jié)果相似，表明細(xì)胞在耐藥后倍增時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)藥物敏感性降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，耐藥株G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，增殖指數(shù)減小。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞主要分布于對(duì)藥物相對(duì)不敏感的時(shí)期如G0/G1期時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出耐藥性［26］。

Figure 4.Death rates of NU-DUL-1-R cells induced by combination of acalabrutinib （Aca） and rituximab （RTX）.A：the complement-dependent cytotoxicity（CDC）of Aca and RTX detected by flow cytometry；B：the antibody-dependent cellmediated cytotoxicity（ADCC）of Aca and RTX detected by flow cytometry.P：PBMCs.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs con?trol group；##P<0.01 vs Aca（6 μmol/L）group；△△P<0.01 vs RTX group；☆☆P<0.01 vs Aca（12 μmol/L）group；▲P<0.05，▲▲P<0.01 vs RTX+Aca（6 μmol/L）group.圖4 阿卡替尼聯(lián)合利妥昔單抗誘導(dǎo)的NU-DUL-1-R細(xì)胞死亡率

在此基礎(chǔ)上，通過采用不同濃度的Aca處理NUDUL-1-R 細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)NU-DUL-1-R 細(xì)胞的增殖均受到顯著抑制，且呈劑量依賴性，因此為了明確不同濃度的Aca 是否都對(duì)RTX 有增敏效果，我們選取了IC50與1/2 IC50這兩個(gè)有代表性的濃度來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)對(duì)于RTX，為了保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中RTX 在不同靶細(xì)胞數(shù)量下一定是足量的，且更能代表患者治療過程中體內(nèi)血藥濃度，我們將實(shí)驗(yàn)中RTX 的終濃度 設(shè)置 為100 mg/L［27］。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于CDC 和ADCC 效應(yīng)來說，聯(lián)用組NU-DUL-1-R 細(xì)胞比單藥組死亡率更高，證明Aca 加強(qiáng)了RTX 誘導(dǎo)的CDC 作用和ADCC作用。

DLBCL 的發(fā)生發(fā)展與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)［28］，結(jié)合我們之前的研究及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是GCB 型還是非GCB 型DLBCL，IL-17 均可以通過下調(diào)p53 來抑制淋巴瘤的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，而RTX 會(huì)上調(diào)IL-17 的分泌，這也與其耐藥有關(guān)［29-31］。因此我們體外實(shí)驗(yàn)探討了Aca 對(duì)IL-17 分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aca 處理后IL-17 分泌顯著減少。而RTX 單藥組Th17 細(xì)胞比例增加，IL-17 的分泌增加，結(jié)合我們前期的結(jié)果，我們認(rèn)為，Aca 和RTX 聯(lián)用時(shí)其Th17 細(xì)胞的比例顯著降低，分泌的IL-17 減少，抑制p53的表達(dá)，促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡［30］。

綜上所述，我們通過體外實(shí)驗(yàn)證明了Aca 能通過降低Th17細(xì)胞比例，恢復(fù)RTX作用之后Th17/Treg比例的失衡，減少IL-17 的分泌，來增強(qiáng)RTX 對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷作用。但這一作用尚需在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，從而為兩藥聯(lián)合、增強(qiáng)RTX療效來治療耐RTX的非GCB型DLBCL提供更多理論依據(jù)。

Figure 5.Effect of acalabrutinib（Aca）combined with rituximab（RTX）on the proportion of Th17 cells and the level of IL-17.A：the proportion of Th17 cell detected by flow cytometry；B：the level of IL-17 detected by ELISA.Mean ± SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs RTX group.圖5 阿卡替尼和利妥昔單抗對(duì)Th17細(xì)胞比例及IL-17水平的影響