張暑軍， 李青青， 喬春林， 勾 璇， 王新敏， 章 樂△

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子 832008）

膀胱癌是常見的惡性腫瘤，在泌尿生殖道腫瘤中膀胱癌發(fā)病率位居第一位［1］。研究表明，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，而腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的主要組成部分，在膀胱癌浸潤免疫細胞中的比例可高達50%［2-3］。腫瘤相關(guān)巨噬細胞活化類型分為兩種表型：M1 型和M2 型［4］。M1 型巨噬細胞可被干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）或脂多糖（lipopolysac?charide，LPS）激活，并分泌大量促炎細胞因子如白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，表達高水平的CD86 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要誘導(dǎo)Th1 型免疫應(yīng)答，被稱為腫瘤殺傷性巨噬細胞，一直被認(rèn)為具有抑瘤效應(yīng)［5-6］。但研究顯示，M1 型巨噬細胞也存在促瘤作用，可參與腫瘤的惡性進展。在乳腺癌中，M1 型巨噬細胞能誘導(dǎo)乳腺癌細胞T47-D和MCF-7的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并增強誘導(dǎo)細胞的遷移和侵襲能力［7］；在腦膠質(zhì)瘤中，M1型巨噬細胞可促進腦膠質(zhì)瘤U251 細胞的侵襲［8］。目前M1 型巨噬細胞在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍不清楚。本項工作以小鼠膀胱癌細胞株MB49 為研究模型，并轉(zhuǎn)化小鼠RAW264.7 巨噬細胞為M1 型巨噬細胞，將其與MB49細胞通過Transwell小室進行體外雙層共培養(yǎng)，觀察M1型巨噬細胞對MB49細胞活力、遷移、侵襲及凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

小鼠RAW264.7 巨噬細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫；小鼠膀胱癌MB49細胞購自中國上海賽百慷生物有限公司。 胎牛血清購自Bioloical Industries；DMEM、青-鏈霉素和PBS 購自Gibco；LPS 購自Sig?ma；CCK-8 購自日本同仁公司；抗小鼠CD86 抗體購自Invitrogen；兔抗iNOS 抗體購自Abcam；兔抗CD86抗體購自Bioss；小鼠CD86-PE 流式抗體購自Invitro?gen；Hoechst 33258、裂解液PMSF 和RIPA、Western blot 制膠液均購自北京索萊寶科技有限公司；0.4 μm和0.8 μm的Transwell小室購自Corning。

2 方法

2.1 RAW264.7 細胞和MB49 細胞的培養(yǎng)配制完全培養(yǎng)液（含1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液），將細胞置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。觀察細胞狀態(tài)并換液，當(dāng)培養(yǎng)瓶細胞生長至80%～90% 時予以傳代。傳代培養(yǎng)3次后取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞向M1 型極化將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞按3×108L?1接種于6孔板中，培養(yǎng)液每孔2 mL，鋪板后細胞培養(yǎng)12 h，以此時記為0 h，然后加入不同濃度的LPS刺激，分別為0、50、100 和200 μg/L 4 個組，每組3 個復(fù)孔，培養(yǎng)細胞24 h［9-10］。

2.3 免疫熒光細胞化學(xué)染色法檢測RAW264.7 巨噬細胞iNOS 和CD86 表達情況取出LPS 刺激24 h后的細胞，4% 多聚甲醛固定細胞15 min，Triton X-100 破細胞膜3 min，加入牛血清白蛋白于37 ℃恒溫封閉30 min，分別加入兔抗iNOS抗體（1∶100）和小鼠抗CD86 抗體（1∶100），置于濕盒內(nèi)37 ℃恒溫孵育3.5 h，在暗室中滴加FITC 標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶50）和FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗（1∶50），避光，置于37 ℃環(huán)境中孵育2 h，PI（1∶1 000）染核10 min，甘油封片［9］。采集細胞圖像，再進行半定量分析。

2.4 Western blot 分析RAW264.7 巨噬細胞iNOS 和CD86 蛋白表達情況取出細胞，加入配好的裂解液（PMSF∶RIPA 為1∶100），每孔100～200 μL，將6 孔板置于冰盒上裂解20～30 min。干凈的細胞刮刮落貼壁細胞，將液體吸至1.5 mL 的EP 管中，提前預(yù)冷離心機至4 ℃，13 684×g離心15 min，測定蛋白濃度，配平，加入loading buffer，煮蛋白100 ℃，10 min，冷卻后蛋白于?80 ℃冰箱保存。制膠（5% 濃縮膠和10% 分離膠）；電泳，電壓為80 V，2 h；濕轉(zhuǎn)，電壓為80 V，1.5 h。于搖床上室溫封閉2～3 h，用含50 g/L 牛血清白蛋白的TBST 配制Ⅰ抗（兔抗鼠CD86 單克隆抗體按1∶1 000稀釋，兔抗鼠iNOS單克隆抗體按1∶500稀釋，鼠抗β-actin 單克隆抗體按1∶10 000 稀釋）；Ⅱ抗為HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶10 000）或羊抗鼠IgG（1∶20 000）；化學(xué)發(fā)光試劑盒（A 液∶B 液=1∶1）顯影，并于暗室壓片［11］。掃描條帶灰度值。圖像采集后使用ImageJ 軟件進行分析，分別計算CD86 和iNOS 與β-actin的比值。

2.5 流式細胞術(shù)檢測RAW264.7 巨噬細胞表面CD86 的表達情況胰酶消化收集巨噬細胞，用1×PBS 洗2 次，細胞表面CD86 的表達情況用直接免疫熒光法進行檢測。每100 μL的1× PBS加入抗體（PE標(biāo)記的CD86 抗體）1 μL，用配好的抗體稀釋液重懸細胞，避光，置于37 ℃環(huán)境中，染色30 min。1× PBS洗2次，加入300～500 μL的1× PBS重懸細胞，上機檢測［11］。實驗結(jié)果為膜分子表達陽性細胞百分率。

2.6 構(gòu)建巨噬細胞與膀胱癌細胞的共培養(yǎng)體系實驗分為3 組：MB49 組、MB49 與M0 巨噬細胞共培養(yǎng)組（M0+MB49 組）及MB49 與M1 巨噬細胞共培養(yǎng)組（M1+MB49 組），于6 孔板上放置膜孔徑為0.4 μm的Transwell 培養(yǎng)小室，將MB49 細胞和不同亞型的RAW264.7 巨噬細胞制備成均勻的細胞懸液，上層按實驗分組分別加入M0 和M1 亞型巨噬細胞，下層加入膀胱癌細胞MB49，構(gòu)建共培養(yǎng)體系，2種細胞均勻分布于各層，共培養(yǎng)。

2.7 CCK-8 實驗檢測各組MB49 細胞的活力將不同分組的MB49細胞制備成均勻的細胞懸液，每組進行細胞計數(shù)，把細胞密度調(diào)整為4×107L?1，每個試驗組設(shè)3 個復(fù)孔；保證每孔細胞密度基本相同，按上述實驗分組將單細胞懸液以每孔4×103接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；在24 h 后將96 孔板終止培養(yǎng)。每孔加入CCK-8 溶液10 μL，輕輕混勻，把培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中2 h；利用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度（A）值；計算細胞相對活力，并行統(tǒng)計分析。

2.8 劃痕實驗檢測各組MB49細胞水平方向的遷移能力待實驗組中MB49 細胞長至90% 左右時，用10 μL 吸頭垂直6 孔板筆直劃出兩條水平的劃痕，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，洗去劃掉的細胞，然后加入無血清的DMEM 培養(yǎng)液，顯微鏡拍照，此時記為0 h，繼續(xù)于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再次于顯微鏡下拍照，用ImageJ軟件計算各組MB49細胞遷移的面積。

2.9 Transwell實驗檢測各組MB49細胞的侵襲及垂直方向的遷移能力取出細胞，胰酶消化MB49收集細胞，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細胞，向Transwell小室中放入無血清培養(yǎng)液重懸的細胞，保證各組細胞數(shù)量一致。Transwell 侵襲實驗需提前在小室中鋪上一層基質(zhì)膠；于24孔板下室中加入500 μL含20% 血清的完全培養(yǎng)液，將小室放入24 孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出Transwell 小室，PBS 洗兩次，4% 多聚甲醛固定30 min；0.1% 結(jié)晶紫染色20 min，PBS 洗3次，棉簽擦去小室里未遷移的細胞；風(fēng)干小室，再于倒置熒光顯微鏡下拍照［12］；用直接計數(shù)法或ImageJ軟件計算出各組MB49細胞穿過的數(shù)量。

2.10 Hoechst 33258 染色檢測各組MB49 細胞的凋亡情況取出細胞，棄上清液，PBS 洗3 次，4% 多聚甲醛固定10～15 min；PBS 洗3 次，加入稀釋好的Hoechst 33258 染色液500 μL，室溫避光孵育20～30 min；PBS 洗3 次，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照［13］，用ImageJ軟件計算出各組MB49細胞凋亡的數(shù)量。當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，Hoechst 33258 染料穿透細胞膜與雙鏈DNA 結(jié)合，產(chǎn)生比熒光染料自身更強的熒光。因此，凋亡細胞的熒光強度高于正常細胞。若鏡下觀察細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，即熒光顯微鏡下觀察到亮藍光，說明細胞發(fā)生凋亡。

2.11 ELISA 檢測各組炎癥因子IL-6 的水平收集各組共培養(yǎng)后的細胞培養(yǎng)液上清于EP管中，1 100×g離心5 min，每組取100 μL細胞培養(yǎng)液加入至已被抗體包被的96 孔酶標(biāo)板中，按照ELISA 試劑盒說明書對IL-6的含量進行檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均為至少3 次獨立重復(fù)實驗結(jié)果，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用方差分析（或t檢驗）進行組間差異比較，并進一步采用LSD 進行組間兩兩比較。GraphPad Prism 5.0 軟件作圖。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Western blot 檢測LPS 刺激后RAW264.7 巨噬細胞中CD86和iNOS蛋白表達水平

Western blot 結(jié)果顯示，0、50、100 和200 μg/L 的LPS刺激巨噬細胞24 h后，與對照組（即0 μg/L組）相比，RAW264.7巨噬細胞的CD86和iNOS蛋白表達均不同程度地升高，各組CD86蛋白的相對表達量分別為 1.00±0.00、1.11±0.10、1.31±0.16 和 1.12±0.09），各組iNOS 蛋白的相對表達量分別為1.00±0.00、3.45±1.24、5.24±0.60 和1.51±0.68；當(dāng)LPS濃度為100 μg/L時，CD86及iNOS蛋白的表達水平最高，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1、2。

2 免疫熒光檢測LPS 刺激后RAW264.7 巨噬細胞中iNOS和CD86蛋白表達及分布

Figure 1.The expression of CD86 protein in macrophages detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group.圖1 Western blot檢測巨噬細胞CD86蛋白的表達

Figure 2.The expression of iNOS protein in macrophages detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group；△P<0.05 vs 100 μg/L LPS group.圖2 Western blot檢測巨噬細胞iNOS蛋白的表達

免疫熒光結(jié)果顯示，0、50、100 和200 μg/L 的LPS刺激巨噬細胞24 h后，與對照組（即0 μg/L組）相比，巨噬細胞上的CD86 和iNOS 蛋白表達均不同程度地升高，激光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光亮度增強，各組CD86 蛋白的相對表達量分別為0.03±0.00、0.05±0.00、0.06±0.00 和0.05±0.01，各 組iNOS 蛋白的相對表達量分別為0.05±0.01、0.06±0.00、0.08±0.00 和0.07±0.01；當(dāng)LPS 濃 度 為100 μg/L 時，CD86 及iNOS 蛋白表達最高，激光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光亮度最亮，與對照組及50 μg/L LPS 組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3、4。

3 流式細胞術(shù)檢測100 μg/L LPS 刺激RAW264.7巨噬細胞后M1型巨噬細胞所占比例

免疫熒光及Western blot 結(jié)果顯示100 μg/L LPS組M1 型標(biāo)志物CD86 和iNOS 蛋白表達最高，進一步通過流式細胞術(shù)檢測100 μg/L LPS 組M1 型巨噬細胞所占比例，結(jié)果顯示，100 μg/L LPS組CD86陽性細胞百分率為（95.60±3.21）% ，顯著高于對照組［（39.17±2.62）%，P<0.01］，見圖5。

4 M1巨噬細胞抑制MB49細胞的活力

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養(yǎng)后，CCK-8 實驗檢測各組MB49 細胞活力。結(jié)果顯示，與單獨的MB49 組（1.00±0.00）相比，MB49+M0組細胞活力（0.96±0.01）顯著下降（P<0.01）；與MB49+M0 組相比，MB49+M1 組細胞活力（0.77±0.02）顯著下降（P<0.01），見圖6。

5 M1型巨噬細胞抑制MB49細胞的遷移能力

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養(yǎng)后，細胞劃痕測各組MB49細胞遷移能力。結(jié)果顯示，MB49 組細胞的遷移面積為（30.83±1.90）%，MB49+M0 組細胞的遷移面積為（21.85±0.56）%；與MB49 組及MB49+M0 組相比，MB49+M1 組MB49 細胞的遷移面積為（10.00±0.84）%，遷移能力受到顯著抑制（P<0.01），見圖7。

Figure 3.Immunofluorescence detection of CD86 expression on the surface of macrophages.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group；△P<0.05 vs 100 μg/L LPS group.圖3 免疫熒光檢測巨噬細胞表面CD86的表達

Figure 4.Immunofluorescence detection of iNOS expression on the surface of macrophages.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=5.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group；△P<0.05 vs 100 μg/L LPS group.圖4 免疫熒光檢測巨噬細胞表面iNOS的表達

6 M1型巨噬細胞抑制MB49細胞的遷移和侵襲能力

Figure 5.Flow cytometric detection of CD86 expression in macrophages.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control group.圖5 流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞CD86的表達

Figure 6.The viability of MB49 cells in each group detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖6 CCK-8檢測各組MB49細胞活力

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養(yǎng)后，Transwell實驗檢測各組MB49細胞遷移和侵襲能力。（1）遷移能力：MB49+M1 組遷移至Transwell 小室濾膜下表面的細胞數(shù)為63.8±5.7，顯著（P<0.01）低于MB49 組（214.0±13.7）和MB49+M0 組（167.2±13.0）；（2）侵襲能力：MB49+M1 組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數(shù)為32.0±4.6，顯著（P<0.01）低 于MB49 組（160.8±9.9）和MB49+M0 組（131.2±8.0），見圖8。

7 M1型巨噬細胞促進MB49細胞的凋亡

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養(yǎng)后，Hoechst 33258染色檢測各組MB49細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，MB49 組凋亡細胞百分率為（11.80±0.84）%；與MB49 組相比，MB49+M0 組凋亡細胞百分率為（16.04±1.97）%，細胞凋亡數(shù)量顯著增多（P<0.01）；與MB49 組及MB49+M0 組相比，MB49+M1 組凋亡細胞百分率為（47.46±3.74）%，細胞凋亡數(shù)量顯著增多（P<0.01），見圖9。

8 ELISA檢測各組炎癥因子IL-6水平

ELISA 檢測各組炎癥因子IL-6 的分泌水平，結(jié)果顯示，MB49+M1 組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6 的濃度為（72.11±3.66）ng/L，顯著（P<0.05）高于MB49 組［（26.89±10.78） ng/L］和MB49+M0 組［（46.11±6.83）ng/L］，見圖10。

討 論

腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵細胞，在腫瘤存活和進展中起著關(guān)鍵性作用，能響應(yīng)于各種微環(huán)境信號從而改變它的功能表型，主要分為M1型和M2型巨噬細胞［14-15］。

根據(jù)以往的研究，M1 型巨噬細胞一直被認(rèn)為對腫瘤的生長起抑制作用，而M2型巨噬細胞促進腫瘤的生長［2，15］。Jiang 等［16］的研究表明，M1 型巨噬細胞抑制食管鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲。在肺癌中，M1 型巨噬細胞抑制腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［17］。但近年來有研究表明，M1型巨噬細胞存在促瘤的作用，Jin等［8］觀察到M1型巨噬細胞可促進腦膠質(zhì)瘤U251 細胞的侵襲；Bednarc?zyk 等［7］檢測到M1 型巨噬細胞能誘導(dǎo)乳腺癌細胞T47-D 和MCF-7 發(fā)生EMT，并增強細胞的遷移和侵襲能力，靶向M1巨噬細胞可能會抑制EMT并限制乳腺癌的侵襲潛力。目前M1 型巨噬細胞對腫瘤是促進還是抑制作用仍然存在爭議，M1 型巨噬細胞在膀胱癌發(fā)生和進展中的作用仍不明確，有待進行更多的基礎(chǔ)研究。因此，本研究旨在體外明確M1型巨噬細胞對小鼠膀胱癌細胞株的影響。

Figure 7.The migration of MB49 cells in each group detected by scratch assay.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖7 劃痕實驗檢測各組MB49細胞遷移情況

腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的極化與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［18-20］。Takeuchi 等［19］表明，高密度M2 型巨噬細胞在膀胱癌中可影響微血管、病理結(jié)果、腫瘤分級和侵襲性，是預(yù)后較差的因素。有體外實驗和裸鼠移植瘤模型實驗均證實，M2 型巨噬細胞會抑制膀胱癌細胞凋亡，從而促進膀胱癌的增殖和侵襲［20］。而M1 型巨噬細胞與膀胱癌細胞的關(guān)系研究甚少。有研究觀察到，在外界刺激下，巨噬細胞會發(fā)生極化，表型、形態(tài)及功能方面的改變，通常會以旁分泌的方式分泌一些物質(zhì)來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的存活和侵襲［18］。為了觀察微環(huán)境中M1 型極化的巨噬細胞對膀胱癌的影響，本實驗選用小鼠RAW264.7 巨噬細胞和小鼠膀胱癌細胞株MB49 為研究模型。在體外先將RAW264.7 巨噬細胞誘導(dǎo)為M1 亞型，通過對M1 型巨噬細胞表型標(biāo)志物CD86 和iNOS 進行檢測［21-22］，構(gòu)建了成功的M1 型巨噬細胞極化模型且極化比例可達90% 以上，為后續(xù)研究M1型巨噬細胞和小鼠膀胱癌細胞株MB49 的關(guān)系奠定了實驗基礎(chǔ)。本研究隨后將M1 型巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞株MB49通過Transwell小室在體外進行雙層共培養(yǎng)，觀察癌細胞MB49活力、遷移能力和侵襲能力的變化及細胞凋亡的情況，結(jié)果顯示M1型巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞株MB49 共培養(yǎng)后，膀胱癌細胞活力降低，遷移和侵襲能力減弱，細胞凋亡增多，說明M1 型巨噬細胞能抑制小鼠膀胱癌細胞的生長。在以往對膀胱癌的研究中，Dufresne 等［23］觀察到與M1 型巨噬細胞共培養(yǎng)的膀胱癌細胞株T24 其活細胞數(shù)量較低，同時M1 巨噬細胞衍生因子抑制T24 細胞生長；在裸鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中，PD-1 抑制劑nivdumab可使腫瘤組織中M2 型巨噬細胞向M1 型極化，抑制皮下移植瘤的生長速度［20］，這與我們的研究結(jié)果相一致，證明了M1 巨噬細胞在膀胱癌中起抑癌作用。為了進一步探究微環(huán)境中分泌因子與膀胱癌細胞之間的關(guān)系，本實驗觀察了各組中炎癥因子IL-6 的濃度，結(jié)果顯示MB49+M1 組的IL-6 濃度要顯著高于其它組。而M1 型巨噬細胞高分泌促炎因子IL-6，推測M1 型巨噬細胞可能通過分泌促炎因子來影響癌細胞的生長。研究也顯示，豬苓多糖可通過促進巨噬細胞中促炎因子如IL-1β、TNF-α和iNOS以及表面分子CD86、CD16、CD23和CD40的表達，將巨噬細胞極化為M1型，從而可以抑制膀胱癌細胞T24和EJ細胞的增殖，調(diào)節(jié)其凋亡，并抑制遷移和EMT［24］。這些研究進一步支持了我們的推測，說明M1型巨噬細胞分泌的促炎因子可以抑制膀胱癌的生長。但我們在本實驗中只檢測了一種炎癥因子的分泌，且腫瘤具有異質(zhì)性，其微環(huán)境作用關(guān)系較為復(fù)雜，有待更多的研究去證明其中的作用關(guān)系。

Figure 8.The migration and invasion abilities of MB49 cells in each group detected by Transwell assay.The scale bar=100 μm.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖8 Transwell實驗檢測各組MB49細胞遷移和侵襲能力

綜上所述，腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞極化表型的改變影響膀胱癌發(fā)展，M1 型巨噬細胞能夠抑制小鼠膀胱癌細胞的活力、遷移與侵襲，促進膀胱癌細胞的凋亡。目前刺激腫瘤相關(guān)巨噬細胞從M2型到M1型轉(zhuǎn)變已成為腫瘤免疫治療的一種有前途的策略。有研究通過研發(fā)智能納米藥物刺激巨噬細胞表型變化來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［25］。因此，通過改變膀胱癌微環(huán)境中的巨噬細胞極化表型，使其向M1型極化可能是治療膀胱癌的潛在方式，而我們的這一研究也為臨床上膀胱癌的治療提供了參考資料。

Figure 9.The apoptosis of MB49 cells in each group detected by Hoechst 33258 staining.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖9 Hoechst 33258染色檢測各組MB49細胞凋亡情況

Figure 10.The secretion levels of inflammatory factor IL-6 de?tected by ELISA.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs MB49 group；#P<0.05 vs MB49+M0 group.圖10 ELISA檢測各組炎癥因子IL-6的分泌水平