韋青海，沈瑞敏，周偉澤，梅道源

（武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

“酵素”是以果蔬或糧食為原料，或保留或經(jīng)微生物發(fā)酵代謝形成一些活性成分[1]，具有潤腸通便、解酒護(hù)肝、凈化血液、消炎抗菌等功能，在食品、化妝品和農(nóng)業(yè)中有較廣泛的應(yīng)用[2]。近年來，關(guān)于酵素的研究也在逐步深入，但大多采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酵素，生產(chǎn)周期較長。黃海、戰(zhàn)偉偉、楊婧娟等人[3-5]分別采用固態(tài)發(fā)酵研制了不同的復(fù)合酵素。梁貴秋等人[6]以桑葚為原料自然發(fā)酵，通過錯流過濾系統(tǒng)分離出混合菌群，利用混合菌群制備桑葚酵素。楊培青等人[7]對以藍(lán)莓加工過程產(chǎn)生的廢棄物-果渣為核心原料，完善優(yōu)化了發(fā)酵工藝。另外，蔣增良、盧夢瑤等人[8-9]也分別對酵素的生物活性進(jìn)行了研究，以及從酵素中分離鑒定了一株高產(chǎn)醋酸菌。試驗以圣女果為原料直接利用活性干酵母和乳酸菌粉分步液態(tài)發(fā)酵制備圣女果酵素，并研究其抗氧化活性，不僅大大縮短酵素的生產(chǎn)周期，簡化生產(chǎn)步驟，而且可以利用圣女果的營養(yǎng)價值制備出具有通便、美白、抗前列腺癌效果的健康食品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圣女果，產(chǎn)自廣西百色；酵素（食品級），世康食品專營店提供；安琪活性干酵母（食品級），安琪酵母提供；酸奶發(fā)酵劑（食品級），北京川秀科技有限公司提供；乙二胺四乙酸二鈉（AR）、三羥甲基氨基甲烷（AR）、鄰苯三酚（AR）、維C（AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；DPPH（優(yōu)級純），福建領(lǐng)江生物科技有限公司提供。

1.2 主要儀器

TS-2102型振蕩培養(yǎng)箱，上海天呈實驗儀器制造有限公司產(chǎn)品；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；UV-2000型可見紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；AL104型電子天平，梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

圣女果→預(yù)處理→打漿→殺菌→發(fā)酵→檢測。

1.3.2 操作要點

（1）圣女果預(yù)處理。圣女果去皮、去梗、切碎。

（2）打漿。將稱取好的圣女果，加50%純凈水，20%糖混合均勻打漿。

（3）殺菌。將上述圣女果原漿于95℃水浴條件下殺菌30 min。

（4）發(fā)酵。將滅菌后的圣女果原漿接種經(jīng)活化的酵母菌，放置于振蕩培養(yǎng)箱中一次發(fā)酵后，再接種酸奶發(fā)酵劑二次發(fā)酵。

（5）檢測。對一次發(fā)酵液進(jìn)行SOD酶活力檢測，對二次發(fā)酵液進(jìn)行SOD酶活力和總酸檢測。

1.3.3 一次發(fā)酵條件的優(yōu)化

取100 g圣女果進(jìn)行預(yù)處理、打漿、滅菌后接種活化后的酵母菌，進(jìn)行發(fā)酵溫度（20，24，28，30，34，38，42℃）、接種量（0，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%）、pH值（3.7，3.8，3.9，4.0，4.1）、和發(fā)酵時間（8，16，24，32，40 h）的單因素試驗，并用四因素三水平L9（34）正交試驗優(yōu)化一次發(fā)酵條件。

1.3.4 二次發(fā)酵條件優(yōu)化

在上述1.3.3的最優(yōu)條件下繼續(xù)接種酸奶發(fā)酵劑，進(jìn)行發(fā)酵溫度（33，36，39，42，45℃）、接種量（0，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%）、pH值（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）、和發(fā)酵時間（8，16，24，32，40，48 h）的單因素試驗，并用雙指標(biāo)四因素三水平L9（34）正交試驗優(yōu)化二次發(fā)酵條件。

1.3.5 圣女果酵素的性質(zhì)研究

用上述最優(yōu)條件制備圣女果酵素，并以維C為對照品對自制圣女果酵素和市售酵素進(jìn)行抗氧化活性研究。

1.3.6 檢測方法

SOD酶活檢測方法參考GB/T 5009.171，總酸檢測方法參考GB/T 12456，抗氧化活性測定方法參考陳爽等人[10]的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 一次發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

一次發(fā)酵單因素試驗結(jié)果見圖1。

圖1 一次發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，在一次發(fā)酵過程中，溫度的增加，中間產(chǎn)物中SOD酶活先增加后減小；酵母菌接種量的增加，SOD酶活先急劇增加后趨于平緩；pH值的增加，SOD酶活基本呈先增后減的趨勢；發(fā)酵時間的增加，SOD酶活先急劇增加后趨于平緩?？紤]成本和效率因素，把一次發(fā)酵的溫度32℃，活性干酵母接種量0.5%，pH值4.0，發(fā)酵時間16 h作為單因素發(fā)酵最佳條件，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化一次發(fā)酵條件。

2.2 一次發(fā)酵正交試驗結(jié)果

一次發(fā)酵正交試驗結(jié)果見表1。

表1 一次發(fā)酵正交試驗結(jié)果

由表1可知，在一次發(fā)酵的各因素中，發(fā)酵溫度為主要影響因素，接種量、pH值、發(fā)酵時間的影響程度依次遞減，此時最優(yōu)組合為A2B2C3D2，而在9組試驗中，最優(yōu)組合為A2B2C3D1。相同環(huán)境下通過驗證試驗得出A2B2C3D2條件下SOD酶活為593.231 U/mL，A2B2C3D1條件下SOD酶活為560.268 U/mL。故一次發(fā)酵最優(yōu)組合為A2B2C3D2。

2.3 二次發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

二次發(fā)酵單因素試驗結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在二次發(fā)酵中，發(fā)酵溫度的增加圣女果酵素中總酸和SOD酶活均呈下降趨勢；酸奶發(fā)酵劑接種量的增加，圣女果酵素中總酸和SOD酶活均呈先增加后減小的趨勢；隨著pH值的增加，酵素中總酸的含量逐漸減小，而SOD酶活先增加后減小；隨著發(fā)酵時間的增加，酵素中總酸和SOD酶活均基本呈先增后減的趨勢。綜合考慮，酵素中SOD酶活和總酸的含量，分別選擇最佳的二次發(fā)酵單因素條件為發(fā)酵溫度33℃，酸奶發(fā)酵劑接種量0.2%，pH值5.5，發(fā)酵時間40 h，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化二次發(fā)酵條件。

圖2 二次發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

2.4 二次發(fā)酵正交試驗結(jié)果

二次發(fā)酵正交試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，影響二次發(fā)酵的主次因素依次為發(fā)酵溫度（A）>發(fā)酵時間（D）>接種量（B）>pH值（C），二次發(fā)酵最優(yōu)組合為A1B1C1D2，此時總酸含量為0.219 g/L，SOD酶活為324 U/mL。

表2 二次發(fā)酵正交試驗結(jié)果

2.5 圣女果酵素抗氧化性質(zhì)研究

圣女果酵素抗氧化性質(zhì)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，對比自制圣女果酵素、市售酵素和維C，對DPPH自由基清除能力大小依次為自制酵素>市售酵素>維C標(biāo)準(zhǔn)品；對羥自由基清除能力大小依次為維C標(biāo)準(zhǔn)品>自制酵素>市售酵素；對超氧陰離子清除能力排序為維C標(biāo)準(zhǔn)品>市售酵素>自制酵素。且從質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長趨勢可以看出，該圣女果酵素適宜抗氧化質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%。

圖3 圣女果酵素抗氧化性質(zhì)結(jié)果

3 結(jié)論

圣女果酵素最優(yōu)發(fā)酵條件為水添加量50%，白砂糖添加量20%，發(fā)酵溫度32℃，活性干酵母接種量0.5%，pH值4.1，發(fā)酵時間16 h進(jìn)行一次發(fā)酵；發(fā)酵溫度30℃，乳酸菌接種量0.1%，pH值5.0，發(fā)酵時間36 h進(jìn)行二次發(fā)酵。此時SOD酶活為324 U/mL，總酸含量為0.219 g/mL。

該圣女果酵素的抗氧化能力較強，其中DPPH自由基的清除能力超過了維C，對羥自由基的清除能力接近維C，但對超氧陰離子的清除能力明顯低于維C，適宜抗氧化質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%。