梁俊輝 陳澤銳 彭樹明 陳善嘉 舒柏榮

【摘要】 目的 探討叉頭框蛋白B2（FOXB2）對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法 采用定量PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7細(xì)胞FOXB2 mRNA的表達(dá)，構(gòu)建過表達(dá)FOXB2的細(xì)胞模型，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)過表達(dá)效率，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測(cè)FOXB2對(duì)Huh7細(xì)胞增殖能力的影響;平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXB2對(duì)Huh7細(xì)胞克隆形成能力的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXB2對(duì)Huh7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果 FOXB2在肝癌細(xì)胞系Huh7和Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常肝細(xì)胞LO2（P<

0.001）;過表達(dá)FOXB2抑制了Huh7細(xì)胞的增殖（P=0.005）和克隆形成（P<0.001）;FOXB2過表達(dá)肝癌細(xì)胞的遷移（P<0.001）和侵襲（P=0.002）能力低于Vector對(duì)照細(xì)胞。結(jié)論 FOXB2在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，F(xiàn)OXB2過表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞癌;叉頭框蛋白B2;增殖;侵襲;遷移

Effect of overexpression of forkhead box B2 on proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells Liang Junhui△， Chen Zerui， Peng Shuming， Chen Shanjia， Shu Bairong. △Department of General Surgery， Guangdong Provincial People’s Hospital Nanhai Hospital， Foshan 528200， China

Corresponding author， Shu Bairong， E-mail： shubrmd@163.com

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of forkhead box protein B2 （FOXB2） on the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells. Methods The expression levels of FOXB2 mRNA in normal liver cells LO2， hepatocellular carcinoma cells Hep3B and Huh7 were detected by quantitative PCR. The cell model overexpressing FOXB2 was constructed. The overexpression efficiency was assessed by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot. The effect of FOXB2 on Huh7 cell proliferation was evaluated by cell counting kit-8 （CCK-8）. The effect of FOXB2 on the clone formation of Huh7 cells was determined by plate cloning assay. The effect of FOXB2 on the invasion and migration of Huh7 cells was detected by Transwell chamber test. Results The expression levels of FOXB2 in hepatocellular carcinoma cells Huh7 and Hep3B were significantly lower than that in normal liver cells LO2 （both P<0.001）. Overexpression of FOXB2 significantly inhibited the proliferation （P=0.005） and clone formation （P<0.001） of Huh7 cells. In the Huh7-FOXB2 overexpression group， the invasion （P=0.002） and migration capabilities （P<0.001） of hepatocellular carcinoma cells were significantly lower than that in the Vector control cells. Conclusions FOXB2 is lowly expressed in hepatocellular carcinoma cells. Overexpression of FOXB2 suppresses the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】 Hepatocellular carcinoma; Forkhead box protein B2; Proliferation; Invasion; Migration

目前肝細(xì)胞癌（肝癌）是病死率較高的惡性腫瘤之一[1]。盡管近年肝癌的基礎(chǔ)和臨床研究取得較大進(jìn)展，但肝癌患者的5年生存率仍然很低[2]?，F(xiàn)有的多種療法依然具有明顯不良反應(yīng)[3]。尋找早期診斷的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善肝癌患者的預(yù)后是十分必要的。果蠅胚胎中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子叉頭框蛋白（FOX）在控制細(xì)胞周期、上皮分化和代謝以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等許多生物學(xué)過程中有重要的作用，且具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。FOXB2是FOX蛋白家族的重要成員之一，研究顯示FOXB2抑制了胰腺癌細(xì)胞Panc-1的惡性表型[4]。FOXB2在肝癌中的作用筆者尚未見有相關(guān)報(bào)道，為此進(jìn)行本研究，旨在闡明FOXB2在肝癌中的作用。

材料與方法

一、試劑與耗材

胎牛血清（FBS）、雙抗抗生素、高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛;細(xì)胞培養(yǎng)板（6、24、96孔板）、Transwell小室（8 μm）購自Corning公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNAiso Plus試劑、TB Green? 逆轉(zhuǎn)錄快速熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑購自寶生物工程有限公司;FOXB2抗體購自Immunoway公司;GAPDH抗體購自Santa Cruz Biotechnology;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購自北京銳抗生物科技有限公司;0.22 μm的聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自Millipore公司;結(jié)晶紫購自Sigma-Aldrich公司。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，添加10 000 kU/L的鏈霉素和10 000 kU/L青霉素于培養(yǎng)基中。于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至90%時(shí)進(jìn)行傳代，隔日進(jìn)行細(xì)胞換液。

2. qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)水平

按照說明書應(yīng)用RNAiso Plus試劑從細(xì)胞中獲取總RNA，NanoDrop測(cè)定RNA濃度。RT體系為10 μL，模板DNA產(chǎn)物常規(guī)稀釋10倍;采用TB Green? Fast qPCR Mix試劑進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。引物由華大基因合成。引物序列：GAPDH上游5’-CTACACTGAGCACCAGGTG

GTC-3’，下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG

-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度115 bp;FOXB2上游5’-GCTGAGCG

ACATCTACAAGTTC-3’，下游5’-GAATCTTGATG

AAGCAGTCGTTG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度119 bp。2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3. 構(gòu)建過表達(dá)FOXB2細(xì)胞系

轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞為Vector組，轉(zhuǎn)染FOXB2重組質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞為FOXB2組;細(xì)胞轉(zhuǎn)染的前一日，消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后鋪于24孔板;細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)日，取Opti-MEM稀釋質(zhì)粒;加入Lipofectamine 3000，培養(yǎng)20 min;取Lipofectamine 3000在Opti-MEM中稀釋;將混合液加入對(duì)應(yīng)各孔中后搖勻;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)FOXB2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

4. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞15 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度。95℃變性5 min，10%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質(zhì)，0.22 μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，抗體（FOXB2 1∶1000;GAPDH 1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次8 min，抗體室溫孵育2 h;TBST洗滌3次，每次8 min，使用增強(qiáng)ECL底物在BIO-RAD Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)曝光;使用Image J進(jìn)行圖像分析。

5. CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

96孔板每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（含有5×103個(gè)細(xì)胞），每組3個(gè)復(fù)孔，不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（Vector）;然后分別于預(yù)先制定好的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（24、48、72 h），向檢測(cè)孔中加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀上在450 nm處測(cè)定吸光度（D450）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6. 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

取Vector對(duì)照組和FOXB2過表達(dá)組的細(xì)胞以1×103 /孔的密度鋪板6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)1周，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后用0.2%結(jié)晶紫染色，相機(jī)拍照并計(jì)數(shù)克隆個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力

按試劑盒說明書將5×104細(xì)胞接種在24孔板中。預(yù)定時(shí)間收集細(xì)胞并將其懸浮在無血清培養(yǎng)基中。遷移能力時(shí)將細(xì)胞置于未涂Matrigel膠的上腔室中。侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)將上室的膜按1∶8稀釋并涂Matrigel膠。所有下腔室均充滿500 μL含25%FBS的培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于上室培養(yǎng)24 h后，在200倍物鏡下使用顯微鏡在3個(gè)視野中對(duì)遷移或侵襲的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以 表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LO2、Hep3B、Huh7細(xì)胞中FOXB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

人肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7細(xì)胞的FOXB2 mRNA表達(dá)水平低于人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞（F = 321.6，P < 0.001），見圖1。

二、FOXB2過表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Vector組細(xì)胞相比，F(xiàn)OXB2組細(xì)胞的FOXB2 mRNA（t = 21.85，P < 0.001）和蛋白（t = 7.19，P = 0.002）相對(duì)表達(dá)量均明顯上調(diào)，見圖2A～C。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)FOXB2在72 h明顯抑制了Huh7細(xì)胞的增殖能力（t = 5.61，P = 0.005），見圖2D。

三、FOXB2過表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞克隆形成的影響

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXB2明顯抑制了Huh7細(xì)胞的克隆形成能力（t = 19.41，P < 0.001），見圖3。

四、FOXB2過表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXB2明顯抑制了肝癌細(xì)胞Huh7的遷移（t = 7.32，P = 0.002）和侵襲（t = 10.58，P < 0.001） 能力，見圖4。

討 論

肝癌仍然是危害人類健康的公共衛(wèi)生難題之一，在全球范圍內(nèi)仍然有增加的趨勢(shì)[1]。盡管近年肝癌的診斷和治療研究方面均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但其5年生存率仍然較低，主要原因?yàn)楦伟┰缙谂R床表現(xiàn)缺乏特異性，大部分肝癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移及相關(guān)并發(fā)癥是造成肝癌患者死亡的主要原因[5]。肝癌患者根治性切除術(shù)后5年累積復(fù)發(fā)率約為70%，有大約90%的患者因發(fā)生轉(zhuǎn)移而死亡[6]。因此，深入研究肝癌的具體分子機(jī)制仍然是該領(lǐng)域的重點(diǎn)。

FOX蛋白家族由一組進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子組成，其特征是一個(gè)共同的DNA結(jié)合域，稱為叉頭盒結(jié)構(gòu)域。該家族包括19個(gè)亞族，具有翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或稱叉頭結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制作用，使FOX具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。FOX蛋白家族參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和其他生物過程。FOX蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子的解除調(diào)控對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。在人類中，根據(jù)序列相似性，F(xiàn)OX基因被分為19個(gè)亞組。在癌細(xì)胞中，許多FOX基因被認(rèn)為是抑癌基因或促癌基因。例如，F(xiàn)OXO和FOXM1轉(zhuǎn)錄因子的平衡通過競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)靶基因胰島素樣生長(zhǎng)因子，整合了腺苷5’-磷酸腺苷，活化蛋白激酶介導(dǎo)的代謝和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。FOXK1和FOXK2在調(diào)節(jié)線粒體功能、代謝和凋亡中起重要作用[7]。作為FOX家族蛋白的一員，BRAF突變陽性的結(jié)直腸癌中FOXB2的5’區(qū)CpG島存在異常甲基化。Fukuchi等[4]研究顯示，F(xiàn)OXB2在胰腺癌細(xì)胞系Panc-1細(xì)胞中低表達(dá)，其5’端的CpG島高度甲基化，表明FOXB2可能受到抑制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FOXB2抑制了Panc-1細(xì)胞的惡性特征。

本研究顯示，與正常肝細(xì)胞相比，F(xiàn)OXB2在肝癌細(xì)胞中低表達(dá);過表達(dá)FOXB2抑制了肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，同時(shí)降低了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究初步探討了FOXB2在肝癌中的作用，為后續(xù)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)，但FOXB2在肝癌中的具體作用機(jī)制依然不明確，日后將進(jìn)一步研究FOXB2在肝癌中的具體分子機(jī)制。為改善肝癌患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)新的肝癌藥物干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.

[2] Erstad D J， Tanabe K K. Prognostic and therapeutic implications of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma. Ann Surg Oncol， 2019， 26（5）：1474-1493.

[3] Lee D H， Lee J M， Kim P N， et al. Whole tumor ablation of locally recurred hepatocellular carcinoma including retained iodized oil after transarterial chemoembolization improves progression-free survival. Eur Radiol， 2019， 29（9）：5052-5062.

[4] Fukuchi H， Hayashida Y， Inoue K， et al. Forkhead box B2 inhibits the malignant characteristics of the pancreatic cancer cell line Panc-1 in vitro. Genes Cells， 2019， 24（10）：674-681.

[5] Villanueva A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med， 2019， 380（15）：1450-1462.

[6] Rankin E B， Giaccia A J. Hypoxic control of metastasis. Science， 2016，352（6282）：175-180.

[7] Sakaguchi M， Cai W， Wang C H， et al. FoxK1 and FoxK2 in insulin regulation of cellular and mitochondrial metabolism. Nat Commun， 2019， 10（1）：1582.

（收稿日期：2021-05-18）

（本文編輯：林燕薇）