王岸娜，楚雯文，吳立根

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

蛋白和多糖是兩種生物大分子物質(zhì)，關(guān)于它們的相互作用在食品領(lǐng)域有著廣泛的研究[1-2]。淀粉是最常見的多糖，是食品中的重要成分，常與蛋白共存于食品體系中，兩者相互作用的研究對食品的質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性和感官特性等具有指導(dǎo)意義[3]。

小麥蛋白是從小麥粉中提取的植物源蛋白質(zhì)[4]，具有高度聚合的狀態(tài)[5]，根據(jù)溶解性的不同，可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。在食品加工中小麥蛋白與淀粉緊密結(jié)合[6]，研究發(fā)現(xiàn)小麥蛋白富含谷氨酰胺，谷氨酰胺的氨基和淀粉葡萄糖單元的第二或第三羥基之間會形成氫鍵[7]，在淀粉糊化和回生過程中，單體蛋白(清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白)與淀粉的氫鍵作用力更強[8]。它們的相互作用影響著食品的流變學(xué)特性[3,9]、糊化特性[10]和消化特性[11-12]，因此從分子層面上闡述兩者的相互作用具有重要意義。

盡管近年來對小麥蛋白與淀粉相互作用的研究越來越深入，但很少涉及具體成分之間的研究，直鏈淀粉作為淀粉的主要組成部分，與小麥蛋白的相互作用研究較少，結(jié)合位點和作用機制尚不明確。因此，作者通過紫外光譜、熒光光譜和同步熒光技術(shù)測定兩者相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點和熱力學(xué)參數(shù)，判斷直鏈淀粉與4種蛋白的相互作用以及結(jié)合機制，以期對淀粉基食品的設(shè)計提供新思路，對改善食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷朊粉：封丘縣華豐粉業(yè)有限公司；直鏈淀粉：卡邁舒生物科技有限公司；氯化鈉、乙醇、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南佰澤儀器有限公司；Cary Eclipase熒光分光光度計：美國VARIAN；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥蛋白的制備及含量測定

根據(jù)蛋白溶解性的不同，采用Osborne法[13]分級提取蛋白，以蒸餾水、3%氯化鈉溶液、75%乙醇溶液和0.2%氫氧化鈉溶液為溶劑，料液比為1∶ 10 g/mL，從谷朊粉中依次提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，離心后取上清液過濾備用。

谷朊粉總蛋白質(zhì)含量的測定：參照GB 5009.5—2016，采用雙縮脲法[14]測定4種小麥蛋白含量。

1.3.2 小麥蛋白-直鏈淀粉復(fù)合體系的制備

小麥蛋白-直鏈淀粉復(fù)合體系的制備參照徐興鳳[15]使用的方法并加以修改。清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白用相應(yīng)試劑稀釋至質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將不同質(zhì)量濃度(0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL)的直鏈淀粉溶液[16]加入蛋白溶液中，等體積均勻混合反應(yīng)30 min。

1.3.3 紫外光譜的測定

室溫下，分別掃描4種蛋白與不同質(zhì)量濃度直鏈淀粉復(fù)合體系的紫外光譜，掃描范圍為200～400 nm。

1.3.4 熒光光譜的測定

1.3.4.1 熒光猝滅光譜及猝滅類型

在溫度298 K和310 K的條件下測定小麥蛋白-直鏈淀粉復(fù)合體系的內(nèi)源熒光，設(shè)定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為300～450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm和10 nm。

根據(jù)Stern-Volmer方程(1)可以確定直鏈淀粉和4種蛋白的熒光猝滅機制：

(1)

方程(1)中：F0為只存在蛋白時的熒光強度；F為添加直鏈淀粉之后的熒光強度；[Q]為直鏈淀粉的物質(zhì)的量濃度；KSV為相互作用的猝滅常數(shù)；Kq為相互作用的猝滅速率；τ0為熒光分子平均壽命，一般取10-8s。

1.3.4.2 結(jié)合位點和結(jié)合常數(shù)

直鏈淀粉和4種蛋白的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點通過雙對數(shù)方程(2)計算。

(2)

方程(2)中：Ka為相互作用的結(jié)合常數(shù)；n為相互作用的結(jié)合位點。

1.3.4.3 結(jié)合力類型

由Van’t Hoff方程(3)和熱力學(xué)方程(4)得到反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔH(焓變)、ΔS(熵變)和ΔG(自由能)。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS，

(4)

方程(3)和(4)中：K為與溫度T相對應(yīng)的結(jié)合常數(shù)；T為試驗溫度(298 K和310 K)；R為氣體常數(shù)，8.314 J·mol-1·K-1。

根據(jù)參數(shù)的大小和正負可以判斷相互作用力類型：當ΔH<0，ΔS<0時，作用力為氫鍵和范德華力；當ΔH>0，ΔS>0時，作用力為疏水相互作用；當ΔH<0，ΔS>0時，作用力為靜電相互作用。

1.3.5 同步熒光光譜的測定

在室溫下掃描復(fù)合體系Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜，掃描范圍200～350 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

以牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y=0.053 8x+0.006 1(R2=0.999 5)。

谷朊粉中總蛋白含量為60.68%，其中清蛋白占比為2.49%，球蛋白為3.38%，醇溶蛋白為40.41%，谷蛋白為32.07%。

2.2 紫外光譜

紫外吸收光譜是一種研究蛋白結(jié)構(gòu)變化的方法，也是確定猝滅機理的一種手段。在蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜中，280 nm左右的吸收峰主要是由于芳香族氨基酸殘基的苯雜環(huán)結(jié)構(gòu)的π→π*躍遷形成的B吸收帶，對于動態(tài)猝滅，僅影響了發(fā)色團的激發(fā)態(tài)，紫外吸收光譜不發(fā)生變化，對于靜態(tài)猝滅，直鏈淀粉與蛋白形成復(fù)合物，吸收光譜發(fā)生變化。

如圖1所示，清蛋白在270 nm處有吸收峰，球蛋白在265 nm處有吸收峰，吸收谷均在245 nm處，隨著直鏈淀粉質(zhì)量濃度的升高，吸收峰和吸收谷消失，在吸收谷的位置出現(xiàn)了新的肩峰；醇溶蛋白的吸收峰在278 nm處，直鏈淀粉的加入使吸收峰紅移，250 nm處出現(xiàn)新的肩峰，這表明直鏈淀粉使醇溶蛋白肽鏈伸展，躍遷所需能量減少，吸收峰向長波移動；谷蛋白的吸收峰在280 nm處，隨著直鏈淀粉濃度的增加，峰形和吸收峰波長沒有發(fā)生變化，吸收峰的強度增加可能是由于發(fā)色團的微環(huán)境發(fā)生了改變。紫外吸收光譜圖的改變表明4種蛋白和直鏈淀粉發(fā)生相互作用形成基態(tài)復(fù)合物，初步證實了直鏈淀粉對4種蛋白熒光猝滅的機制是靜態(tài)猝滅。

注：曲線a到h對應(yīng)的直鏈淀粉質(zhì)量濃度分別為0、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL。圖2、圖3同。圖1 直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectroscopy of interacting between amylose and four proteins

2.3 熒光光譜

2.3.1 熒光猝滅光譜及猝滅類型的確定

從圖2可以看出，在298 K時4種蛋白的熒光強度隨著直鏈淀粉質(zhì)量濃度的增加而降低，310 K時的熒光強度的變化趨勢與298 K時相同(圖省略)，因此直鏈淀粉對4種蛋白均具有熒光猝滅作用。直鏈淀粉質(zhì)量濃度為0.30 mg/mL時，清蛋白的熒光猝滅率為52.7%，最大發(fā)射峰紅移9 nm，可能是由于清蛋白中含有較多的色氨酸[17]，因此直鏈淀粉對清蛋白的猝滅率較高。球蛋白的熒光猝滅率為60.8%，最大發(fā)射峰紅移2 nm。醇溶蛋白的熒光猝滅率為35.4%，發(fā)射峰紅移3 nm，且峰形有所變化，由于醇溶蛋白是單肽鏈，呈球狀，相互作用改變了其構(gòu)象，使肽鏈伸展程度增加。在天然蛋白質(zhì)分子中，色氨酸和酪氨酸多處于分子內(nèi)部，周圍微環(huán)境極性較弱，在加入直鏈淀粉后，蛋白質(zhì)肽鏈舒展，氨基酸側(cè)鏈基團暴露于溶液中，微環(huán)境極性增大，熒光基團的疏水性減小，蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰紅移，表明直鏈淀粉的加入改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，二者發(fā)生了相互作用。谷蛋白的熒光猝滅率僅為22.8%，最大發(fā)射峰為353 nm，直鏈淀粉并未使谷蛋白最大發(fā)射峰發(fā)生改變，可能由于谷蛋白是線性高分子，因此直鏈淀粉對谷蛋白猝滅率較弱，微環(huán)境改變較小。

圖2 直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of interaction between amylose and four proteins

不同溫度下直鏈淀粉猝滅4種蛋白的猝滅常數(shù)(KSV)和猝滅速率(Kq)如表1所示，在298 K和310 K時，擬合方程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。4種蛋白的猝滅速率均大于2×1010L·mol-1·s-1，可以認為猝滅方式不是動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)分子之間形成了復(fù)合物，因此溫度升高會導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性變差，猝滅常數(shù)減小。由表1可知，直鏈淀粉對4種蛋白的猝滅常數(shù)均隨著溫度的升高而降低?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以判斷直鏈淀粉對4種蛋白的熒光猝滅是由于相互作用形成了復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

2.3.2 結(jié)合位點及結(jié)合常數(shù)的確定

不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點如表2所示。結(jié)合常數(shù)表示直鏈淀粉與蛋白結(jié)合的強度，數(shù)值越大結(jié)合力越強。由表2可知，清蛋白、球蛋白與直鏈淀粉的結(jié)合力比醇溶蛋白和谷蛋白弱，這可能是由于清蛋白和球蛋白多為單體結(jié)構(gòu)。清蛋白和球蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點隨著溫度的升高而降低，表明結(jié)合過程是放熱的，結(jié)合位點小于1表明直鏈淀粉不易滲透到蛋白內(nèi)部的疏水腔；醇溶蛋白和谷蛋白的結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而升高，表明結(jié)合過程是吸熱的，結(jié)合位點均大于1表明這兩種蛋白與直鏈淀粉形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定，結(jié)合力比較強。

2.3.3 熱力學(xué)參數(shù)及作用力的確定

不同溫度下，直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)如表3所示。清蛋白-直鏈淀粉和球蛋白-直鏈淀粉體系的ΔH、ΔS和ΔG均為負值，表明這兩種體系的主要作用力類型為氫鍵和范德華力，并且結(jié)合過程是放熱、焓驅(qū)動的自發(fā)過程，因此在溫度升高時，不利于這兩種體系的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)下降。Lian等[18]發(fā)現(xiàn)清蛋白和球蛋白的賴氨酸殘基存在于蛋白肽的末端，賴氨酸殘基的—NH2可與淀粉葡萄糖殘基的親水性—OH通過氫鍵結(jié)合。醇溶蛋白-直鏈淀粉和谷蛋白-直鏈淀粉體系的ΔH和ΔS均為正值，ΔG為負值，表明這兩種體系的主要作用力為疏水相互作用，結(jié)合過程是吸熱、熵驅(qū)動的自發(fā)過程，因此在溫度升高時，可促進這兩種體系的相互作用，使結(jié)合常數(shù)上升。直鏈淀粉腔內(nèi)是疏水性的，可為非極性部分提供具有高親和力的結(jié)合位點[19]，醇溶蛋白和谷蛋白的α-螺旋存在于N端和C端結(jié)構(gòu)域中，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角存在于中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域中[20]，這些含有脯氨酸和酪氨酸殘基的中心重復(fù)結(jié)構(gòu)域可以形成疏水相互作用[21]。醇溶蛋白和谷蛋白表面暴露著大量酪氨酸殘基，在與淀粉的相互作用中酚羥基既是氫鍵的供體又是受體，因此醇溶蛋白、谷蛋白與直鏈淀粉形成復(fù)合物主要的驅(qū)動力為疏水作用力，也存在氫鍵。

表1 不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的猝滅方程及猝滅常數(shù)Table 1 Quenching equations and quenching constants for the interactions between amylose and four proteins at different temperatures

表2 不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點Table 2 Binding constants and binding sites of interaction between amylose and four proteins at different temperatures

表3 不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between amylose and four proteins at different temperatures

2.4 同步熒光光譜

直鏈淀粉與4種蛋白在常溫下相互作用的同步熒光光譜如圖3所示。由圖3可以看出，色氨酸殘基比酪氨酸殘基具有更大的熒光強度。當Δλ=15 nm時，清蛋白最大發(fā)射峰紅移了8 nm，球蛋白最大發(fā)射峰紅移了10 nm，醇溶蛋白隨著直鏈淀粉質(zhì)量濃度的增大最大發(fā)射峰趨于水平，因此直鏈淀粉使清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的酪氨酸殘基周圍微環(huán)境親水性增加；當Δλ=60 nm時，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的最大發(fā)射峰并未發(fā)生改變，說明直鏈淀粉沒有對這3種蛋白的色氨酸殘基微環(huán)境的極性造成影響。而谷蛋白的最大熒光發(fā)射峰波長均無顯著性變化，即酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境變化不明顯，與紫外光譜結(jié)果一致。清蛋白酪氨酸殘基的熒光降低率為81.8%，色氨酸殘基的熒光降低率為57.3%；球蛋白酪氨酸殘基的熒光降低率為69.9%，色氨酸殘基的熒光降低率為61.5%；醇溶蛋白酪氨酸殘基的熒光降低率為70.0%，色氨酸殘基的熒光降低率為46.0%；谷蛋白酪氨酸殘基的降低率為20.1%，色氨酸殘基的降低率為23.3%。說明4種蛋白的酪氨酸殘基與色氨酸殘基均參與了結(jié)合過程，清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白與直鏈淀粉的結(jié)合位點更接近于酪氨酸殘基，而谷蛋白與直鏈淀粉的結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基。

圖3 直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of interaction between amylose and four proteins

3 結(jié)論

采用紫外光譜法、熒光光譜法及同步熒光法研究了清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白與直鏈淀粉的相互作用機制。通過靜態(tài)猝滅機制，直鏈淀粉可與4種蛋白生成復(fù)合物，能夠有效猝滅4種蛋白的內(nèi)源熒光。清蛋白和球蛋白與直鏈淀粉通過氫鍵和范德華力結(jié)合，結(jié)合力較弱，是放熱、焓驅(qū)動的自發(fā)過程；醇溶蛋白和谷蛋白主要通過疏水相互作用結(jié)合，結(jié)合力較強，是吸熱、熵驅(qū)動的自發(fā)過程。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的結(jié)合位點更接近酪氨酸殘基，谷蛋白的結(jié)合位點更接近色氨酸殘基。