常 越，唐 翠，徐 輝，曹相玫，劉仲濤

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，銀川 750004）

CD47蛋白也稱為整聯(lián)素關(guān)聯(lián)蛋白（integrinassociated protein，IAP），分子質(zhì)量為50 kDa，屬于免疫球蛋白超家族中的一員，是普遍分布于細(xì)胞外表面的跨膜蛋白。已知CD47的天然配體有：整合素、血小板凝集素-1和信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα），CD47可以和SIRPγ有微弱的結(jié)合[1-2]。研究[3]表明，CD47經(jīng)過與其配體聯(lián)合阻礙巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，從而逃脫免疫監(jiān)督。所以，CD47參與的生物學(xué)作用包括細(xì)胞的黏附、遷移及抑制巨噬細(xì)胞吞噬調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[4]。近年來，CD47在免疫治療方面研究較多，抗腫瘤T細(xì)胞免疫作用可通過抗CD47抗體的介導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能的啟動[5-7]。相較于CD47低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，高表達(dá)CD47的腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的存活能力，因而CD47高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可以避免被先天免疫系統(tǒng)攻擊[8-9]。CD47作為一種避免巨噬細(xì)胞吞噬的信號分子，將有可能成為某些癌癥的治療靶點(diǎn)。因此，本研究構(gòu)建了hCD47基因重組慢病毒并檢測了其在人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究CD47基因在惡性腫瘤中的生物學(xué)功能及重要意義奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen-IRESPuro、293T、U87細(xì)胞、HEK293細(xì)胞系（北京西貝宏程生物科技有限公司）；GeneCopoeiaGCI-L3化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、HEK293T慢病毒包裝細(xì)胞系（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）；離心管、DMEM培養(yǎng)液、PVDF、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、無血清培養(yǎng)液和胰酶（寧夏朗凱生物科技有限公司）；針頭濾器（美國Millipore公司）；凝聚胺（polybrene）、質(zhì)粒抽提試劑盒（上海玉博生物科技有限公司）；NotI、BamHI限制性內(nèi)切酶（New England Biolabs有限公司），DNA Ladder Marker（北京諾爾塞克科技有限公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國Omega公司），In-Fusion PCR Cloning Kit（美國Clontech公司），Taq polymerase、dNTP（北京義翹神州科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1hCD47目的基因擴(kuò)增hCD47mRNA的DNA序列從GenBank資料庫中獲得，引物根據(jù)目的基因的載體位點(diǎn)和序列設(shè)計合成，上游引物5’-CTAGGCGGCCGCGCCACCATGTGGC CCCTGGTA GCGGCGCTG-3’（含有NotI酶切位點(diǎn)），下游引物5’-CGCGGATCCTTACTTGTCCGTCATCCTTG-3’（含有BamHI酶切位點(diǎn)），利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 15μL，dNTP Mix（2.5 mmol·L-1）5μL，正向及反向引物各（10μmol·L-1）1μL，F(xiàn)astPfu polymerase 2μL，模板DNA（100 ng·μL-1）1μL，ddH2O 25μL，合計50μL總體系。PCR反應(yīng)流程參考文獻(xiàn)[10]，變性：95℃預(yù)加熱5 min，使DNA完全變性；退火：95℃迅速降溫至55℃退火30 s，使模板與引物充分退火；延伸：72℃延伸2 min，重復(fù)循環(huán)35次，最后，72℃保持10 min，使產(chǎn)物延伸完整。

1.2.2 hCD47重組慢病毒載體構(gòu)建和鑒定[11]慢病毒載體質(zhì)粒pLVX 2μg，10×CutSmart Buffer 2μL，各取1μL的NotI和BamHI，加ddH2O補(bǔ)足至總體系20μL，酶切反應(yīng)在37℃水浴反應(yīng)3 h。取25μL目的基因質(zhì)粒pcDNA3.1-hCD47，10×Buffer CutSmart 3μL，NotI和BamHI各1μL，加ddH2O補(bǔ)足至30μL。1%的瓊脂糖凝膠電泳回收質(zhì)粒pLVX酶切大片段和目標(biāo)基因酶切小片段。將PCR產(chǎn)物與T載體、連接酶緩沖液以及T4DNA連接酶混合連接，在16℃下反應(yīng)12 h以上。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化：1）在-80℃冰箱中取感受態(tài)細(xì)胞50μL融化，與質(zhì)粒1μL輕輕混合放冰上30 min；2）調(diào)42℃水浴鍋，將混合好的離心管放入90 s，取冰于泡沫盒，將離心管轉(zhuǎn)移冰上3 min；3）取適量養(yǎng)好的細(xì)胞涂布于培養(yǎng)好的LB培養(yǎng)基上，室溫保存30 min，待放置干燥后，將培養(yǎng)皿顛倒放置于37℃的培養(yǎng)箱中過夜，次日查看培養(yǎng)皿中是否有菌落。選擇其中生長的一些單菌落進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3 重組慢病毒的制備與純化 轉(zhuǎn)染前18～24 h，將2.5×106個293T細(xì)胞置于10 cm培養(yǎng)皿中并在37℃孵育過夜。待細(xì)胞達(dá)到65%～70%融合度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)移載體和包裝質(zhì)粒加入Opti-MEM中，通過完全培養(yǎng)基來混合。將轉(zhuǎn)染試劑加入同一試管中，渦旋10 s，在室溫下孵育混合物15 min，將其加到培養(yǎng)皿中，并渦旋使其均勻分布，繼續(xù)37℃條件下培養(yǎng)。收集上清液，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。將收集到的上清液倒入15 mL離心管中，2 000×g離心10 min，并用過濾器（0.22μm）過濾后轉(zhuǎn)到新管中。病毒顆粒制備完成，可在4℃下儲存2周，或等分后長期儲存在-80℃，待用。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞觀察轉(zhuǎn)染效率 在六孔板接種U87細(xì)胞30%融合度約1×105個細(xì)胞，加入MEM完全培養(yǎng)基，37℃及5%CO2培養(yǎng)12～16 h，細(xì)胞貼壁后，加入構(gòu)建好的含hCD47目的基因慢病毒。繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，在倒置熒光顯微鏡下觀察48 h、72 h的熒光范圍和熒光強(qiáng)度，以獲得轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 Western blot檢測CD47蛋白表達(dá)水平 提取蛋白，分為空白對照組（NC）和轉(zhuǎn)染慢病毒組（hCD47）。采用BCA法定量蛋白濃度。取定量過的蛋白相同量上樣，80 V電泳。隨后270 mA 60 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入TBST洗膜3次，每次10 min。搖床封閉2 h，封閉過后，放于一抗孵育盒，4℃過夜。次日復(fù)溫30 min，TBST搖床洗膜，二抗室溫孵育1.5 h。底物顯色：取上述處理過的PVDF膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)。各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro的鑒定

利用限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI對重組慢病毒載體進(jìn)行雙酶切酶鑒定，在（1.0～2.0）kb可見擴(kuò)增帶，且與目標(biāo)hCD47片段大?。? 058 bp）一致。鑒定結(jié)果表明，質(zhì)粒pLVX-hCD47重組慢病毒載體克隆為陽性克隆，見圖1。

圖1 酶切鑒定結(jié)果

2.2 pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

hCD47重組慢病毒pLVX-hCD47-3flag-Zs-Green-Puro轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染24 h綠色熒光的強(qiáng)度以及白光圖，并用逐孔稀釋梯度法進(jìn)行滴度測定。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24 h后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，測得pLVX-hCD47病毒滴度為1×108TU·mL-1，表明hCD47慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可能隨著細(xì)胞傳代穩(wěn)定遺傳，見圖2。

圖2 hCD47重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h熒光圖（×400）

2.3 pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重組慢病毒1μL轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h在倒置熒光顯微鏡下可見明顯綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率在90%以上，見圖3。

圖3 hCD47重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h熒光圖（×400）

2.4 pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞

重組慢病毒轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞48 h、72 h后，倒置熒光顯微鏡下可見GFP熒光，其中72 h熒光強(qiáng)度明顯，接著進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選，見圖4。

圖4 hCD47重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞（×40）

2.5 Western blot檢測U87細(xì)胞中CD47蛋白表達(dá)水平

結(jié)果顯示，hCD47組CD47蛋白表達(dá)水平高于NC組（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染hCD47目的基因效果明顯，見圖5。

圖5 Western blot檢測CD47蛋白表達(dá)水平

3 討論

CD47是一種分布廣泛的50 kDa五跨膜受體，它包括細(xì)胞內(nèi)的C端跨膜蛋白以及細(xì)胞外的N端IgV結(jié)構(gòu)域，具備四種有差異的選擇性剪接亞型，僅在細(xì)胞質(zhì)段長度上有所不同[12]。其可以在人體內(nèi)編碼獲得，可以與整合素、SIRPα以及血小板生成素（TSP-1）作用，其中與SIRPα作用時，CD47可以發(fā)出“Don’t eat me”信號阻礙巨噬細(xì)胞的吞噬進(jìn)而防止免疫系統(tǒng)傷害健康細(xì)胞[13-15]。由于CD47普遍出現(xiàn)在人類細(xì)胞中且過表達(dá)于多種癌細(xì)胞中，因此，CD47可能參與了免疫系統(tǒng)對腫瘤監(jiān)視的逃逸。

近年來，大量研究[16-17]表明，CD47在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，利用抗CD47抗體對腫瘤生長抑制和預(yù)防各種癌癥轉(zhuǎn)移有明顯作用。因此，CD47作為一種預(yù)測各種癌癥的因子被研究，發(fā)現(xiàn)CD47表達(dá)與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的侵襲預(yù)后有關(guān)，如非小細(xì)胞肺癌[18-19]、胃癌[20]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[21]和黑色素瘤[22]等。當(dāng)CD47與SIRPα作用時，可抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能進(jìn)而保護(hù)健康細(xì)胞，因此利用CD47單抗的功能，可中斷CD47與SIRPα的結(jié)合，起到抗腫瘤作用，也有研究[23-24]表明，阻斷CD47可加強(qiáng)腫瘤被巨噬細(xì)胞吞噬的能力。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中惡性程度最高的一種星形細(xì)胞瘤，研究[25]顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲性可以通過CD47激活PI3K/AKT途徑增強(qiáng)。此外，研究通過比較CD47在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與正常腦標(biāo)本和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD47在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，且在U87細(xì)胞株中表達(dá)最為明顯[26-27]。由于膠質(zhì)瘤的侵襲性與CD47過表達(dá)相關(guān)，因此CD47分子可作為多種癌癥的治療靶點(diǎn)。

慢病毒是在人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的治療載體[28]。在已有研究基礎(chǔ)上，本研究為探討hCD47在惡性腫瘤中的作用，制備了hCD47基因重組慢病毒。首先采用PCR擴(kuò)增hCD47目的基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接，得到重組質(zhì)粒pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro，雙酶切結(jié)果鑒別出陽性克隆目的基因。成功構(gòu)建含hCD47目的基因的慢病毒載體，將重組慢病毒載體pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro導(dǎo)入293T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了慢病毒包裝，再用hCD47基因重組慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，HEK293是研究探討基因性能的一個強(qiáng)有力工具，其來源于胚腎，相比其他細(xì)胞株更容易轉(zhuǎn)染，是一個很常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株[29]。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后在倒置熒光顯微鏡下會觀測到綠色熒光，用梯度濃縮法測滴度為1×108TU·mL-1。將構(gòu)建好的hCD47重組慢病毒轉(zhuǎn)入惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中，通過觀測熒光及白光強(qiáng)度范圍獲得轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果在72 h轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%，表明制備的含目的基因的慢病毒可以有效轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞。Western blot結(jié)果同樣證實(shí)了CD47在hCD47轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞中表達(dá)升高，提示隨著細(xì)胞傳代，CD47基因可穩(wěn)定遺傳。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建出hCD47慢病毒載體，且能夠有效轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，獲得穩(wěn)定過表達(dá)CD47的U87細(xì)胞系，為CD47在惡性腫瘤中的作用機(jī)制的深入研究及臨床實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。