李佳琪，馬淑琴，趙 楓，付有娟，姚貴香，關(guān)素珍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

我國女性勞動參與率較高，女性的職業(yè)健康受到了越來越多的關(guān)注[1]，尤其是女性在妊娠期的特殊生理時(shí)期會面臨來自工作、生活、社會中各種不良應(yīng)激事件的心理刺激，不僅對孕婦本身的身體健康產(chǎn)生影響[2]，還會導(dǎo)致宮內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變從而不利于胎兒發(fā)育及后期的成長[3]。腸道菌群（gut microbiota）是腸道特有的微生物群落，通過產(chǎn)生微生物及其代謝物進(jìn)而影響多種代謝和免疫穩(wěn)態(tài)的功能[4]。孕期應(yīng)激已被證實(shí)可對子代的腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[5]，但要深入了解腸道菌群和宿主之間的復(fù)雜關(guān)系，不僅需要了解其結(jié)構(gòu)和功能，還需要進(jìn)一步了解腸道菌群與代謝物之間的聯(lián)系，其中短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝物能夠反映宿主的代謝情況[6]。因此，本研究通過建立孕期慢性應(yīng)激大鼠模型，觀察孕期應(yīng)激致仔鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和靶向代謝物短鏈脂肪酸改變，分析子代腸道菌群與短鏈脂肪酸的關(guān)系，進(jìn)而為孕期應(yīng)激對子代發(fā)育影響的機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

本研究選擇健康成年SD大鼠，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［合格證編號：SCXK（寧）2015-0001］。其中雌鼠16只，體質(zhì)量（200±20）g；雄鼠12只，體質(zhì)量（200±20）g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌鼠隨機(jī)分為孕期慢性應(yīng)激組（模型組）和對照組，每組各8只；將12只雄鼠隨機(jī)分為模型交配組8只和對照交配組4只。其中模型組雌鼠單籠飼養(yǎng)，對照組雌鼠每籠2只飼養(yǎng)；雄鼠每籠2只飼養(yǎng)。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審核（IACUCNYLAC-2019-089）。

1.2 主要儀器與試劑

131I皮質(zhì)醇放射免疫試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；Illumina Miseq PE300測序平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）；8890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent Technologies公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型構(gòu)建 （1）模型選擇：選擇慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立動物模型。應(yīng)激方式包括：①禁食24 h；②24 h擁擠環(huán)境（8只合籠），籠具傾斜30°；③禁水24 h；④24 h潮濕環(huán)境（濕度60%～70%）；⑤31℃溫水游泳1 h；⑥30 min搖晃（1次/s）；⑦30 min行為束縛；⑧5 min熱應(yīng)激（42℃）；⑨1 min夾尾（距尾尖1 cm處）。模型周期為21 d，期間9種應(yīng)激方式隨機(jī)安排，原則上7 d內(nèi)不出現(xiàn)相同的應(yīng)激方式。應(yīng)激①②③④在24 h進(jìn)行，其余均在當(dāng)天10：00～12：00進(jìn)行。應(yīng)激完成后放回原飼養(yǎng)籠具中。（2）交配過程：模型組在應(yīng)激第3天（17：00）與模型交配組1∶1合籠飼養(yǎng)，第2天早晨檢查雌鼠陰道涂片確認(rèn)妊娠成功與否，確定妊娠后，將雌雄分籠，模型組繼續(xù)單籠飼養(yǎng)。孕期每天對模型組實(shí)施不同的慢性溫和刺激。同期，對照組與對照交配組2∶1合籠飼養(yǎng)，確定妊娠后，對照組每籠2只正常飼養(yǎng)，孕18 d開始單籠飼養(yǎng)。

1.3.2 指標(biāo)的測定（1）孕期CUMS模型確認(rèn)：所有雌鼠在應(yīng)激前1 d，應(yīng)激第1、7、14、21天行內(nèi)眥靜脈采血，將收集的血漿置于-80℃冰箱冷凍待測。利用131I皮質(zhì)醇放射免疫試劑盒測定血漿皮質(zhì)醇濃度，根據(jù)公式：C皮質(zhì)酮=50×C皮質(zhì)醇，得到本次研究所需皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度[7]。當(dāng)模型組大鼠受到應(yīng)激刺激時(shí)，模型組較對照組血漿皮質(zhì)酮濃度升高（P＜0.05），即模型建立成功。（2）仔鼠樣本收集：雌鼠分娩后，仔鼠在出生后21 d斷乳，每組均隨機(jī)抽取16只記為對照仔鼠組（16只，雌雄各半）和模型仔鼠組（16只，雌雄各半），并于當(dāng)天收集兩組仔鼠新鮮糞便至無菌凍存管中，并迅速存放于-80℃冰箱中待測。（3）腸道菌群測序及分析：兩組均隨機(jī)抽取6個(gè)糞便樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA的測序。采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增引物見表1，擴(kuò)增長度為468 bp。利用Miseq PE300平臺進(jìn)行測序，測定大鼠糞便中微生物16S rRNA V3、V4區(qū)序列，使用美吉生物云平臺比較分析雌鼠及子代糞便樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)、組成和差異。α多樣性用來反映屬水平腸道菌群的多樣性，其中Chao、Sobs指數(shù)用來表示物種豐度，Simpson指數(shù)用來表示物種多樣性，Coverage用來表示菌群覆蓋度；Venn圖反映屬水平腸道菌群組成相似性及重疊情況；基于樣本群落數(shù)據(jù)采用組間差異顯著性檢驗(yàn)觀察對照仔鼠組與模型仔鼠組之間物種組成的差異。（4）靶向代謝物測定及關(guān)聯(lián)性分析：精確稱取100 mg糞便樣本于2 mL研磨管中，加入研磨珠和1 mL研磨液（含0.5%磷酸和50μg·mL-1內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸），于冷凍研磨儀50 Hz研磨3 min，研磨2次；冰水浴超聲30 min；4℃靜置30 min；4℃13 000×g離心15 min；取全部上清液到新的1.5 mL離心管中；加入500μL乙酸乙酯于上清溶液中進(jìn)行萃取，渦旋混勻，冰水浴超聲10 min，4℃13 000×g離心10 min，取上清溶液，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行上機(jī)分析。采用MassHunter定量軟件（美國安捷倫公司）默認(rèn)參數(shù)對目標(biāo)短鏈脂肪酸各離子碎片進(jìn)行自動識別和積分，并輔助人工檢查。根據(jù)計(jì)算公式：樣品短鏈脂肪酸含量（μm·mg-1）=（C×V）/M，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)樣品的檢測濃度，換算出樣品中短鏈脂肪酸的實(shí)際含量。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對照組與模型組的血漿皮質(zhì)酮含量采用重復(fù)測量方差分析，通過兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對照仔鼠組和模型仔鼠組腸道菌群的α指數(shù)多樣性；采用單因素方差分析比較子代兩組間短鏈脂肪酸代謝差異；采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）和相關(guān)性Heatmap圖來反映短鏈脂肪酸與腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕期應(yīng)激對母代血漿皮質(zhì)酮含量的影響

對母代對照組與模型組的血漿皮質(zhì)酮含量進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析，結(jié)果顯示兩組之間血漿皮質(zhì)酮濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.717，P=0.024）。模型組在應(yīng)激第7天、14天的血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度高于同時(shí)點(diǎn)的對照組（t=2.341、5.414，P均＜0.05），見表2。

表2 孕期應(yīng)激對母代血漿皮質(zhì)酮含量的影響（±s，ng·mL-1）

表2 孕期應(yīng)激對母代血漿皮質(zhì)酮含量的影響（±s，ng·mL-1）

與同時(shí)點(diǎn)對照組比較*P＜0.05。

組別 n 應(yīng)激前1 d 應(yīng)激后第1天 第7天 第14天 第21天對照組 8 80.44±22.59 95.91±42.74 95.04±14.58 105.48±14.10 96.12±16.92模型組 8 81.14±27.78 92.41±16.47 132.26±16.47* 161.46±18.32* 128.53±42.86

2.2 孕期應(yīng)激對子代腸道菌群構(gòu)成的影響

2.2.1 子代屬水平腸道菌群α多樣性分析 對照仔鼠組的Chao、Sobs、Simpson指數(shù)均高于模型仔鼠組（P均＜0.05），提示孕期應(yīng)激降低了仔鼠物種豐度和物種多樣性；Coverage指數(shù)方面，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示兩組仔鼠屬水平菌群覆蓋度無明顯差異，見圖1。

圖1 孕期應(yīng)激仔鼠腸道菌群α多樣性分析

2.2.2 子代屬水平腸道菌群的物種組成（1）物種組成分析。根據(jù)Venn圖，對照仔鼠組屬水平腸道菌群物種數(shù)138種，模型仔鼠組131種，其中兩組共有物種數(shù)126種，對照仔鼠組獨(dú)有的物種數(shù)為12種，模型仔鼠組5種，模型仔鼠組物種數(shù)目少于對照仔鼠組，見圖2。（2）群落組成分析。兩組屬水平腸道菌群構(gòu)成差異圖顯示，模型仔鼠組乳酸菌屬（Lactobacillus）相對豐度為30.89%，低于對照仔鼠組的35.41%；而模型仔鼠組的norank_f_穆氏桿菌屬相對豐度為21.46%，高于對照仔鼠組的19.48%，見圖3。

圖2 孕期應(yīng)激子代屬水平腸道菌群物種數(shù)目及分布Venn圖

圖3 子代屬水平腸道菌群組間構(gòu)成差異圖

2.3 孕期應(yīng)激對子代短鏈脂肪酸代謝的影響

模型仔鼠組的糞便代謝物短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸的含量均高于對照仔鼠組（P均＜0.05），見表3。

表3 子代組間短鏈脂肪酸濃度比較（x±s，μm·mg-1）

2.4 子代腸道菌群與短鏈脂肪酸含量的相關(guān)性

通過RDA解釋子代屬水平短鏈脂肪酸與腸道菌群的關(guān)系，結(jié)果顯示，對照組仔鼠組與模型仔鼠組的群落之間有差異，戊酸、異戊酸對腸道菌群的影響相差不大，相比之下，乙酸、丙酸和丁酸對腸道菌群的影響較大。各個(gè)短鏈脂肪酸之間都成銳角提示均呈正相關(guān)。通過各樣本到箭頭的投影點(diǎn)距離看出，不同短鏈脂肪酸對相同組別不同樣本群落分布的影響差別不大。坐標(biāo)軸中第一排序軸能（RDA1）為84.54%、第二排序軸能（RDA2）為6.23%，表示橫、縱軸對腸道菌群變化的解釋比例分別為84.54%和6.32%，見圖4A。

采用Heatmap圖來表示物種豐度前20的腸道菌群與短鏈脂肪酸之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，Phascolarctobacterium與丁酸呈負(fù)相關(guān)（r=-0.82，P＜0.05），與異戊酸呈負(fù)相關(guān)（r=-0.82，P＜0.05）；梭菌屬_sensu_stricto_1與丙酸呈正相關(guān)（r=0.94，P＜0.01），與丁酸呈正相關(guān)（r=0.94，P＜0.01），與異戊酸呈正相關(guān)（r=0.94，P＜0.01）；普雷沃氏菌屬_NK3B31_group與乙酸呈正相關(guān)（r=0.81，P＜0.05），與戊酸呈正相關(guān)（r=0.81，P＜0.05），與丁酸呈正相關(guān)（r=0.81，P＜0.05），與異戊酸呈正相關(guān)（r=0.81，P＜0.05）；雙歧桿菌（Bifidobacterium）與丙酸呈正相關(guān)（r=0.83，P＜0.05），見圖4B。

圖4 子代腸道菌群與短鏈脂肪酸含量的相關(guān)性

3 討論

皮質(zhì)酮是母體孕期應(yīng)激影響胎兒發(fā)育的主要介質(zhì)，當(dāng)母體受到應(yīng)激時(shí)，皮質(zhì)酮濃度升高[8]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠第7天、14天測得的血漿皮質(zhì)酮濃度均高于對照組，表明模型組大鼠處于應(yīng)激狀態(tài)，第21天模型組的血漿皮質(zhì)酮濃度有所下降，可能與孕中、后期下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）對應(yīng)激的適應(yīng)有關(guān)[9]。研究[10]表明，慢性應(yīng)激開始時(shí)，血漿皮質(zhì)酮水平升高，一段時(shí)間后有所降低，與本研究結(jié)果相似。

腸道菌群是定植于人體腸道的微生物群落，分為益生菌、致病菌和條件致病菌三類[11]。腸道中菌群分布正常時(shí)對維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)是有益的，一旦菌群失衡，可能會引起機(jī)體慢性病的發(fā)生[12]。研究[13]表明，孕期應(yīng)激會改變母代的腸道菌群結(jié)構(gòu)，分娩時(shí)羊水中的菌群會定植在嬰兒腸道，從而引起子代腸道菌群的改變。本研究通過α多樣性分析顯示，對照仔鼠組腸道菌群的物種多樣性較模型仔鼠組高，模型仔鼠組屬水平物種數(shù)目要低于對照仔鼠組，物種組成也各不相同，以上均提示孕期CUMS對子代腸道菌群的構(gòu)成有影響，與王立鵬[14]的研究結(jié)果一致。對子代屬水平腸道菌群的進(jìn)一步差異分析顯示，模型仔鼠組的乳酸菌屬水平下調(diào)，而普雷沃氏菌屬_NK3B31_group和Akkermansia的水平上調(diào)，與馮彥等[15]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，普雷沃氏菌屬_NK3B31_group與乙酸、異戊酸呈正相關(guān)，普雷沃氏菌屬的主要發(fā)酵物為乙酸、異戊酸等[16]，能夠解釋這一現(xiàn)象，同時(shí)也與模型仔鼠組乙酸、異戊酸代謝量升高的結(jié)果一致。

短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物，能夠反映宿主與腸道菌群之間的聯(lián)系[17]。本研究顯示，模型仔鼠組的乙酸、丙酸和丁酸的代謝量均增高。產(chǎn)生短鏈脂肪酸的腸道菌群主要是擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬和鏈球菌屬[18]。腸道菌群差異分析顯示，模型仔鼠組的雙歧桿菌屬物種豐度高于對照仔鼠組，這可能是導(dǎo)致模型組子代短鏈脂肪酸代謝量升高的原因。有報(bào)道[19]表明，多種環(huán)境因子中短鏈脂肪酸對腸道菌群多樣性的影響最大，本研究結(jié)果顯示，梭菌屬_sensu_stricto_1與短鏈脂肪酸的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，且均呈正相關(guān)，其中乙酸和丁酸與其關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。有研究[20]表明，丁酸主要由梭菌屬產(chǎn)生，乙酸有利于產(chǎn)生丁酸的菌群的生長，以上表明腸道菌群與短鏈脂肪酸有一定的相關(guān)性。

綜上所述，孕期CUMS會使母鼠的血漿皮質(zhì)酮含量升高，使其處于應(yīng)激狀態(tài)，對子代腸道菌群的物種組成及物種多樣性產(chǎn)生影響，從而改變短鏈脂肪酸的代謝水平。短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物與腸道菌群存在關(guān)聯(lián)性。