喬云龍，曾曉龍，黃益芃，楊成

（皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

芽孢桿菌（Bacillus sp.），由于能產(chǎn)生多種胞外生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)及飼料工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1]，其中的抗菌肽類物質(zhì)往往又是該類芽孢桿菌產(chǎn)生的一類主要活性物質(zhì)，它們能夠造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄而具有廣譜抗菌、抗病毒、抗原蟲和抗腫瘤等活性[2-3]，而且芽孢桿菌在一定條件下產(chǎn)生芽孢，對高溫、高壓、強酸堿、擠壓等不良環(huán)境的抵抗力很強，并且具有很強的蛋白酶、淀粉酶等活性，也是開發(fā)新型微生態(tài)多功能劑的首選菌種，且近年來，不斷有新的活性芽孢桿菌菌株及抗菌物質(zhì)被報道[4-6]，因此，對芽孢桿菌類微生物進行研究，為尋找抗生素的替代物開辟了新途徑，同時也能在生物防治、微生態(tài)制劑中發(fā)揮重要作用。

本研究從藥用植物車前草組織篩選出一株對白色念珠菌具有很強抑制活性的芽孢桿菌，擬通過形態(tài)學(xué)觀測、生理生化特征及分子生物學(xué)手段分析明確該活性菌株種屬分類地位，在此基礎(chǔ)上對該菌株胞外抗菌活性物質(zhì)的抗菌特性進行初步研究，為開發(fā)具有抗白色念珠菌活性代謝產(chǎn)物提供一定的資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

芽孢桿菌Y1，白色念珠菌，皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃，15 min；PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃，15 min；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃，15 min。

1.1.3 主要試劑與儀器

HBI芽孢桿菌生化鑒定條，批號20201028，青島海博生物；甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚，分析純，國藥集團。

SHZ-82恒溫振蕩器；ESCD ClassII Biohazard Safe?ty Cabinet生物安全柜；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器；BECKMAN COULTER Allegra 64R Centrifuge冷凍離心機；Olympus顯微鏡；PHS-3C型pH計。

1.2 方法

1.2.1 菌株Y1的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將純化Y1菌株接種至NA培養(yǎng)基上，并置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察其菌落特征并染色鏡檢觀察菌體形態(tài)學(xué)特征。

生理生化特征鑒定：《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]方法進行測定。

分子生物學(xué)鑒定：將純化Y1菌株收集菌體，菌株基因組DNA的提取、擴增以及測序純化由上海生工生物工程股份有限公司完成。采用通用引物7F、1540R進行PCR擴增測序，測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST比對分析，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分類地位。

1.2.2 菌株Y1抗菌活性測試

參考文獻[8]，將斜面保存的Y1菌株，無菌條件下直接挑取適量接種至發(fā)酵液中，37℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下培養(yǎng)45 h，12 000 r/min，離心30 min收集上清液，0.22μm濾膜過濾兩次，作為無菌發(fā)酵液備用待測。然后將白色念珠菌的菌液用無菌水將濃度調(diào)整為1×106CFU/mL，用無菌棉棒直接涂布于PDA平板中，用無菌圓紙片蘸取無菌發(fā)酵液，放置培養(yǎng)皿中，以無菌水對照，輕輕移至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，并測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，取平均值作為該樣本抑菌結(jié)果。

1.2.3 粗提物的制備及其抗菌活性測定

將200 mL上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，分別用20 mL甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚抽提5 h，抽提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得抽提物；將抽提物用無菌水配制成100 mg/mL的抽提物溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾兩次，參照1.2.2操作處理并涂布白色念珠菌液，然后放牛津杯，并讓其自然下沉后，吸取100μL抽提物溶液至牛津杯，輕輕移至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，并測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。

1.2.4 培養(yǎng)基篩選

選擇LB液體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基、改良PDA液體培養(yǎng)基、NB液體培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基，接種45 h后，使用篩選出的最佳有機溶劑，仍按1.2.3方法處理，抽提物溶液濃度為100 mg/mL，實驗重復(fù)3次，篩選較為理想的培養(yǎng)基。

1.2.5 菌株Y1抗菌粗提物穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 粗提物熱穩(wěn)定性測定

分別于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃條件下處理1.2.4中最佳有機溶劑處理的抽提液30 min，以37℃未處理組為對照，采用牛津杯法測定粗提物熱穩(wěn)定性。

1.2.5.2 粗提物的酸堿穩(wěn)定性測定

分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將粗提物溶液pH值分別調(diào)為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，室溫處理1 h后，再依次調(diào)節(jié)為原pH，以原始pH為對照，采用牛津杯法測定粗提物酸堿穩(wěn)定性。

1.2.5.3 粗提物酶穩(wěn)定性實驗

取粗提物溶液，調(diào)節(jié)至最適pH值后，使各酶的終濃度控制在1 mg/mL，胃蛋白酶（pH=2.0），酸性蛋白酶（pH=3.0），堿性蛋白酶（pH=10.0），蝸牛酶，37℃水浴1 h，再調(diào)整為原始pH值，以相同濃度的未經(jīng)酶處理的粗提物作對照，每組設(shè)3個平行，采用牛津杯法測定粗提物酶穩(wěn)定性。

1.2.6 最佳培養(yǎng)時間的確定

按上述篩選的培養(yǎng)基進行配制，按1%接種量接種，180 r/min、37℃進行培養(yǎng)，每隔4 h取發(fā)酵液30 mL，12 000 r/min，離心30 min收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，采用1.2.3中篩選出的最佳有機溶劑2 mL抽提5 h，負(fù)壓蒸干，將抽提物用無菌水配制成50 mg/mL的抽提物溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾兩次，進行抗菌活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y1的形態(tài)學(xué)及生理生化特征

接種于NA培養(yǎng)基，菌株Y1菌落如圖1A所示，菌落乳白色，近圓形，邊緣不規(guī)整，表面較為粗糙，有褶皺。革蘭氏染色觀察如圖1B所示，革蘭氏染色為紫色，陽性菌，菌體呈桿狀，兩端比較圓鈍，芽孢位于菌體中間，呈無色透明折光小體，被菌體包裹。生理生化特征鑒定結(jié)果如表1所示。

圖1 菌株Y1菌落及形態(tài)特征

表1 菌株Y1的生理生化特征

2.2 菌株Y1 16SrDNA序列分析

通過PCR擴增菌株Y1的16SrDNA序列，片段大小1383bp。利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株Y1與芽孢桿菌屬中貝萊斯芽孢桿菌（Bacil?lus velezensisHSB1）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliq?uefaciensBV2007）、枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilisY17B）等菌株序列相似性均為100%（覆蓋率100%）。選取與該種菌株同源性接近的菌株，使用軟件Mega7.0構(gòu)建基于16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），鑒于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌不能產(chǎn)生卵磷酯酶[9-10]，因此，初步將菌株Y1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖2 基于16SrDNA序列構(gòu)建的菌株Y1發(fā)育樹

2.3 拮抗性芽孢桿菌Y1抗菌活性的檢測

拮抗性芽孢桿菌Y1對白色念珠菌表現(xiàn)的拮抗性結(jié)果見圖3B所示，菌株Y1發(fā)酵液上清液對供試白色念珠菌具有明顯的抑制活性，見圖3C所示，抑菌圈平均直徑達到（20.4±0.5）mm，而無菌水對照組（A）沒有出現(xiàn)抑菌圈，表明菌株Y1對供試的白色念珠菌具有明顯的抗菌活性，且抗菌成分可能存在發(fā)酵液中。

圖3 菌株Y1對白色念珠菌拮抗性及抗菌活性

2.4 粗提物的活性測定

根據(jù)抗菌活性測試結(jié)果可知，抗菌活性可能存在于發(fā)酵液中，因此，通過牛津杯法測定不同提取劑（甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚）抽提物抗菌活性，其結(jié)果如圖4所示，甲醇抽提的粗提物活性最高，抑菌直徑達（38±0.4）mm，而乙醚則毫無活性，提示該抗菌活性物質(zhì)的極性較大。

圖4 不同有機溶劑抽提物抑菌活性比較

2.5 不同培養(yǎng)基對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

為了提高菌株Y1抗菌物質(zhì)產(chǎn)量，在同種發(fā)酵條件下，采用常見的5種培養(yǎng)基對菌株Y1進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙氏液體培養(yǎng)基與改良PDA液體培養(yǎng)基可以獲得相對較好的抑菌活性，抑菌直徑均超過了40 mm，如圖5所示，且考慮到改良PDA液體培養(yǎng)基原料易得，成本相對較低，因此，采用改良PDA液體培養(yǎng)基作為進一步實驗的發(fā)酵培養(yǎng)基，其抑菌效果見圖6所示。

圖5 不同培養(yǎng)基抗菌活性比較

圖6 改良PDA培養(yǎng)基的抗菌活性測試結(jié)果

2.6 菌株Y1抗菌粗提物穩(wěn)定性研究

2.6.1 粗提物熱穩(wěn)定性

由圖7可知，粗提物在90℃以下處理30 min后仍然具有較為穩(wěn)定的抗菌活性，100℃處理后，抑菌活性降低至約83%，121℃高溫高壓30 min后活性完全喪失，結(jié)果表明，粗提物抑菌活性在90℃以下具有很好的熱穩(wěn)定性。

圖7 不同溫度處理粗提物后的抑菌活性

2.6.2 粗提物酸堿穩(wěn)定性

由圖8可知，粗提物在不同pH處理1 h后，在pH 2.0～8.0具有較穩(wěn)定抗菌活性和很好的酸堿穩(wěn)定性，如圖8所示，抑菌圈直徑與對照組基本相同。與毛馨[11]等人的研究結(jié)果相似，當(dāng)pH=10時，可能恰好是抑菌活性物質(zhì)最適pH值，抑菌圈最大，達到約（50±0.8）mm，如圖8所示，pH>10.0時，粗提物抑菌活性降低?？梢姡瑥妷A性條件下粗提物活性會受到抑制。

圖8 不同p H下粗提物抗菌活性比較

2.6.3 粗提物酶穩(wěn)定性

由圖9可知，粗提物在經(jīng)過酸性蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和蝸牛酶處理后抗菌活性沒有明顯減弱，具有較好的穩(wěn)定性。

圖9 粗提物的酶穩(wěn)定性比較

2.7 培養(yǎng)時間對抗菌活性的影響

抑菌活性隨著培養(yǎng)時間變長而迅速增強，在發(fā)酵至44 h時抑菌圈直徑達到最大（37.1±0.2）mm，隨后抑菌活性逐漸減弱，這可能是因為菌體生長速度快，導(dǎo)致營養(yǎng)成分不足，限制了活性代謝物質(zhì)的產(chǎn)出，結(jié)果如圖10所示。

圖10 培養(yǎng)時間對抗菌活性的影響

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌[12]相比枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蘇蕓金芽孢桿菌等，分類地位確定比較晚，是芽孢桿菌屬的一個新種。目前，研究者已分離獲得多株具有抗菌活性的貝萊斯芽孢桿菌[13-16]。本研究從車前草中分離獲得一株對白色念珠菌具有抑制活性的貝萊斯桿菌Y1，經(jīng)濾紙片法測定該菌株Y1無菌發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為（20.4±0.5）mm。通過發(fā)酵上清液抗菌抽提粗體物穩(wěn)定性及最佳培養(yǎng)時間測試，表明該抗菌成分具有一定的耐熱性，90℃處理后抑菌活性開始下降，到121℃喪失活性；當(dāng)pH>10.0時，粗提物抑菌活性降低；對蛋白水解酶的水解作用穩(wěn)定性較好，培養(yǎng)到44 h抗菌活性最好，這有利于該菌株進一步大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，開展活性代謝產(chǎn)物的分離純化。因此，接下來對其產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)進行研究，旨在揭示該菌株Y1產(chǎn)生的抗真菌活性成分，為完善貝萊斯芽孢桿菌的拮抗物質(zhì)研究提供依據(jù)。