孔昊，陳杰，王佳琪，張琦，劉嘉慧，張亮

（南京師范大學泰州學院化學與生物工程學院，江蘇泰州 225300）

納米材料是指通過在納米尺度內(nèi)操縱單個分子、原子或分子團，使物質(zhì)成分重新排列組合后制造出的新型物質(zhì)材料。其中，納米二氧化鈦是目前國內(nèi)產(chǎn)量最高、需求量最大、應(yīng)用最多的納米材料[1]。納米二氧化鈦應(yīng)用范圍十分廣泛，如在日用品、醫(yī)藥用品、生物生長等領(lǐng)域[2]。但同時納米二氧化鈦的廣泛應(yīng)用也導致了其在水環(huán)境中大量釋放，對環(huán)境和公眾健康都有潛在的安全隱患[3]。納米材料在生產(chǎn)和使用過程中可直接或間接通過環(huán)境、食物鏈進入人體，因而我們必須關(guān)注其可能存在的安全性問題[4-6]。

ZHU等[7]的研究表明，單獨暴露于2 mg/L納米二氧化鈦或2μg/L三丁基錫不會影響鮑魚（Haliotisrubra）的孵化或畸形率，而聯(lián)合作用卻顯著影響鮑魚的孵化率和變形率，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。ZHENG等[8]的研究表明，納米二氧化鈦對斑馬魚幾乎無毒性效應(yīng)，但能夠抑制凱倫藻（Karenia brevis）和骨條藻（Skeletonemacosta?tum）的生長。文若曦等[9]的研究表明，100 nm納米二氧化鈦對水藻（Desmodesmussubspicatus）的生長無明顯毒性，而25 nm納米二氧化鈦對水藻生長的EC50為44 mg/L。FAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦對藍藻（Cyanobac?teria）的葉綠素含量、光合速率、呼吸速率、SOD活性以及超氧陰離子含量均產(chǎn)生一定的影響。

目前，已有的研究多集中于納米材料對藻類、魚類、植物等的毒性效應(yīng)，而關(guān)于納米材料對小型甲殼動物的研究非常少，尤其是納米二氧化鈦對圓形盤腸溞的相關(guān)研究未見報道[11-13]。由于圓形盤腸溞對生存水環(huán)境質(zhì)量要求較高，可通過測定其存活率與活躍程度間接反映環(huán)境污染物對水環(huán)境的污染情況。本研究以圓形盤腸溞為試驗對象，研究納米二氧化鈦對其急性毒性和理化性質(zhì)的影響。旨在為納米二氧化鈦的合理使用及其風險控制提供重要參考和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料準備

納米級二氧化鈦，分子量79.87，粒徑Ф20 nm，Tita?nium oxide；圓形盤腸溞，上海沁森生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 納米二氧化鈦脅迫下對圓形盤腸溞生存的影響

選取大小均勻一致的圓形盤腸溞，試驗前24 h換自來水并不再喂食。配制相同體積、不同濃度的二氧化鈦溶液后放超聲波溶解儀里，使其均勻分布。取18個大小規(guī)格一樣的玻璃瓶，提前洗凈并瀝干，每瓶放置20只大小均勻的圓形盤腸溞，分別倒入濃度為0 mg/L（對照組1）、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的納米二氧化鈦溶液，每種濃度設(shè)置3組重復試驗，放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25℃，光照周期24 h。把圓形盤腸溞在瓶中停止運動作為死亡標準，每12 h記錄一次圓形盤腸溞的存活數(shù)和死亡數(shù)。

1.2.2 納米二氧化鈦濃度對圓形盤腸溞理化性質(zhì)的影響

根據(jù)1.2.1確定2 mg/L作為急性毒性的試驗濃度，選擇運動活躍且大小均勻的圓形盤腸溞，用清水養(yǎng)殖且24 h內(nèi)不再喂食。用吸管分別吸取50只，加入到濃度為4 mg/L、3 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0 mg/L（對照組2）的納米二氧化鈦溶液中，每瓶培養(yǎng)液體積為100 mL，每個濃度設(shè)置3組重復。在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在12 h、24 h、48 h測量圓形盤腸溞的相關(guān)理化指標。

1.3 測定項目與方法

在培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，取適量圓形盤腸溞，加入磷酸緩沖液碾碎，定容10 mL，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[14]；分別采用氯化硝基四氮唑藍光化學還原反應(yīng)法和愈創(chuàng)木酚法測定超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，采用SPSS19.0進行不同處理間顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化鈦脅迫下對圓形盤腸溞生存的影響

由圖1可知，不同濃度納米二氧化鈦溶液對圓形盤腸溞有不同程度的抑制影響。隨著納米二氧化鈦濃度的增加，圓形盤腸溞的死亡率呈現(xiàn)升高的趨勢。用一元線性回歸方程法求得24 h的EC50值為在納米二氧化鈦溶液濃度為2 mg/L時。

圖1 24 h時不同濃度二氧化鈦對圓形盤腸溞生存特性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of titanium dioxide on the survival characteristics of Chydorussphaericus at 24 h

2.2 納米二氧化鈦對圓形盤腸溞SOD活性的影響

由圖2可見，不同濃度的納米二氧化鈦處理對SOD活性的影響不同。在12 h、48 h時，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，SOD活性呈現(xiàn)出下降的趨勢；而在24 h時，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，SOD活性出現(xiàn)“先升后降”的變化，且在1 mg/L時SOD活性達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了133.82%。當納米二氧化鈦濃度大于3 mg/L時，圓形盤腸溞的SOD活性顯著下降（與0 mg/L的納米二氧化鈦處理相比）。

圖2 納米TiO2對圓形盤腸溞SOD活性的影響Fig.2 Effect of nano titanium dioxide on SOD activity of Chydorussphaericus

2.3 納米二氧化鈦對圓形盤腸溞POD活性的影響

由圖3可見，不同濃度的納米二氧化鈦對圓形盤腸溞POD活性的影響不同。在12 h、48 h時，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，POD活性呈現(xiàn)出下降的趨勢；在24 h時，POD活性隨著納米二氧化鈦濃度的升高呈現(xiàn)出“先升后降”的趨勢，且在1 mg/L時POD活性達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了23.38%。當納米二氧化鈦濃度大于2 mg/L時，圓形盤腸溞的POD活性顯著下降（與0 mg/L的納米二氧化鈦處理相比）。

圖3 納米TiO2對圓形盤腸溞POD活性的影響Fig.3 Effect of nano titanium dioxide on POD activity of Chydorussphaericus

2.4 納米二氧化鈦對圓形盤腸溞MDA含量的影響

由圖4可見，不同濃度的納米二氧化鈦對圓形盤腸溞MDA含量的影響不同。隨著納米二氧化鈦濃度的升高，在12 h時，圓形盤腸溞的MDA含量隨著納米級二氧化鈦濃度的升高呈現(xiàn)“先升后降”的趨勢，在2 mg/L時達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了48.71%；在24 h時，圓形盤腸溞的MDA含量隨著納米級二氧化鈦濃度的升高呈現(xiàn)出上升的趨勢，在4 mg/L時達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了163.15%；在48 h時，圓形盤腸溞的MDA含量在各濃度納米級二氧化鈦條件下無顯著差異。

圖4 納米TiO2對圓形盤腸溞MDA含量的影響Fig.4 Effect of nano titanium dioxide on MDA content of Chydorussphaericus

3 討論

本研究顯示，納米二氧化鈦對圓形盤腸溞的急性毒性為2 mg/L（24 h EC50）。前人研究也多證實納米二氧化鈦對藻類生長具有一定的毒性。朱小山等[15]的研究表明，納米二氧化鈦對斜生柵列藻96 h EC50為15.26 mg/L。也有研究表明，納米二氧化鈦對萊茵衣藻和小球藻生長均有抑制作用，但抑制機理不同。納米二氧化鈦對大型溞的急性毒性試驗顯示48 h EC50為1.26 mg/L，毒性級別為中毒[3]。ZHU等[7]的研究表明，納米二氧化鈦對大型溞有急性和慢性毒性作用，發(fā)現(xiàn)48 h時表現(xiàn)出較低的毒性。圓形盤腸溞作為水環(huán)境中的微生物，對水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著非常重要的作用，納米二氧化鈦對其的毒害作用將影響整個水生生態(tài)系統(tǒng)平衡。

SOD是需氧生物體內(nèi)一種含不同金屬元素的酶蛋白，是唯一可以消耗超氧化物自由基的酶，是已知酶中催化速率較快的酶之一。POD廣泛存在于植物體中，與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其產(chǎn)生的量與氧自由基的量及脂質(zhì)過氧化的程度呈正相關(guān)。李艷娟等[24]的研究表明，各濃度納米二氧化鈦處理都能夠顯著提高杉木幼苗SOD和POD活性，降低MDA的含量。楊濤等[25]的研究表明，納米鐵處理顯著提高了貝母葉片POD活性，降低了MDA含量，但對SOD無顯著影響。侯東穎等[26]的研究表明，藻細胞的SOD活性隨暴露于納米二氧化鈦濃度升高而逐漸降低，且在高濃度（100 mg/L）納米TiO2作用96 h后，其活性降到最低。

本試驗表明，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，SOD和POD活性都呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，MDA含量呈現(xiàn)出上升趨勢。同時，在12 h 2 mg/L的納米二氧化鈦濃度時，圓形盤腸溞SOD活性、POD活性達到最大，同時MDA含量最高。濃度上升到4 mg/L的納米二氧化鈦濃度時，圓形盤腸溞的SOD活性、POD活性和MDA含量呈現(xiàn)些許下降。可能隨著納米二氧化鈦濃度的增大，活性氧清除系統(tǒng)功能逐漸降低，活性氧積累越來越多，發(fā)生膜質(zhì)過氧化并發(fā)生自由基鏈式反應(yīng)?？傮w來說，低濃度的納米二氧化鈦促使溞體POD和SOD活性升高，以保護溞體免受外來刺激和損傷。然而，納米二氧化鈦濃度過高時，就會超出了溞體清除活性氧游離基的能力，導致SOD和POD活性降低。MDA是生物體內(nèi)重要的膜脂過氧化指標，濃度越高的納米二氧化鈦對MDA的損傷程度越大。