程飛宇，馬立娟，李弘軒，朱振昊，張孟灝，韓帥峰，范佳鈺，韓蓓

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

洋蔥是一種常見的廉價家常菜，其肉質(zhì)柔嫩，汁多辣味淡，品質(zhì)佳，適于生食。在國外它被譽(yù)為“菜中皇后”[1]，營養(yǎng)價值較高。洋蔥中含有豐富的黃酮類化合物及花青素，具有抗炎、抗氧化、降血壓、降血脂、抑制腫瘤等生理作用[2]。洋蔥不僅作為一種調(diào)味品，更是膳食中營養(yǎng)和功能成分的重要來源。近年來，隨著人們保健意識的增強(qiáng)，日益強(qiáng)調(diào)食品原料及添加劑的天然性、功能性，因此人們更加關(guān)注洋蔥的功能特性。洋蔥大多被用來直接食用，除此之外，隨著人們對洋蔥的功能活性的深入了解和重視，洋蔥的粗加工和深加工產(chǎn)品也越來越多。洋蔥的粗加工產(chǎn)品主要有脫水洋蔥片、洋蔥醬等；深加工產(chǎn)品有從洋蔥中提取出的黃酮、精油等[3-5]；發(fā)酵產(chǎn)品有洋蔥醋、洋蔥酒等。例如，于亞敏[6]對洋蔥葡萄酒進(jìn)行了開發(fā)，建立了發(fā)酵型洋蔥葡萄酒的生產(chǎn)工藝；江成英等[7]研究了發(fā)酵生產(chǎn)洋蔥糯米酒的主要工藝參數(shù)。隨著對洋蔥深加工的深入研究，越來越多的洋蔥發(fā)酵產(chǎn)品將被研制并生產(chǎn)。

本研究將新鮮紫皮洋蔥中的功能性物質(zhì)黃酮的提取液添加到制備好的麥芽汁中進(jìn)行啤酒發(fā)酵，充分利用洋蔥中的功能活性成分，開發(fā)一種口味獨(dú)特、營養(yǎng)健康的富黃酮洋蔥啤酒。通過考察pH值、富黃酮提取液添加量和酵母接種量等因素對洋蔥啤酒中酒精度和黃酮增長率的影響，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒的發(fā)酵工藝，為富黃酮洋蔥啤酒的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥（新鮮紫皮洋蔥）、蘋果（冰糖心蘋果）：市售；麥芽、酒花（卡斯卡特酒花，α-乙酸含量4.5%～7.0%）、啤酒酵母（Weiss）：帝伯仕啤酒技術(shù)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（酶活4萬U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：南京試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

754型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；MJ-LZ25Easy121多功能三杯榨汁機(jī)研磨機(jī)：佛山佳頓電器有限公司；DK-S82型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SY-100E型多用途恒溫超聲提取儀：北京宏祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DHG-9016A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：太倉精宏儀器設(shè)備有限公司；AR2140型電子分析天平：奧豪斯國際商貿(mào)（上海）有限公司；SPX250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；EXPEC 5230氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：杭州譜育科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥芽汁的制備

將干燥的麥芽進(jìn)行粉碎后放入鍋中，隨后以液料比3∶1（mL/g）向鍋中加入適量的水?dāng)嚢瑁浞只靹?。將其放置于水浴鍋中，?2℃下加熱30 min，隨后升溫至65℃保持70 min，接下來在72℃和78℃各保持10 min進(jìn)行糖化，結(jié)束后過濾。將濾液煮沸并在初沸10、40 min和結(jié)束前10 min 3個時間段分別加入20%、40%、40%的酒花，然后降溫過濾、離心除去雜質(zhì)，最終獲得澄清透明的麥芽汁。

1.3.2 富黃酮提取液的制備

將新鮮的紫皮洋蔥先用自來水洗凈，再用蒸餾水清洗晾干后，放入榨汁機(jī)進(jìn)行粉碎。將粉碎后的洋蔥汁渣倒入錐形瓶中，并向錐形瓶中添加0.5 mg/g的纖維素酶，混勻后在pH4.5、40℃條件下酶解150 min。將酶解后的洋蔥汁渣進(jìn)行超聲處理30 min[8，11-13]，進(jìn)行離心后得到富黃酮提取液。

1.3.3 富黃酮洋蔥啤酒的制備工藝流程

富黃酮洋蔥啤酒的制備工藝流程見圖1。

圖1 富黃酮洋蔥啤酒的制備工藝流程Fig.1 Processing flow of flavonoid-rich onion beer

1.3.4 黃酮含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確配制0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同體積的該標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL試管中，分別加入一定體積的5%的亞硝酸鈉溶液、1%的硝酸鋁溶液和4%的氫氧化鈉溶液，放置15 min，在510 nm條件下測量吸光度。以蘆丁的濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=0.011 7c+0.011 9，R2=0.997 5。

黃酮含量的計算：通過分光光度計測量發(fā)酵前和發(fā)酵后的富黃酮洋蔥啤酒在510 nm條件下的吸光度，再根據(jù)之前得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，代入求出不同樣品所對應(yīng)的黃酮濃度，進(jìn)而確定樣品中黃酮的含量。

黃酮增長率的計算：根據(jù)得到的發(fā)酵前后洋蔥啤酒的黃酮含量來計算不同發(fā)酵條件下的黃酮增長率，公式如下。

式中：R為黃酮增長率，%；M2為啤酒發(fā)酵后的黃酮含量，μg/mL；M1為啤酒發(fā)酵前黃酮的含量，μg/mL。

1.3.5 酒精度的測定

按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》，乙醇體積分?jǐn)?shù)采用酒精計法測定。

1.3.6 啤酒中風(fēng)味物質(zhì)的測量

通過氣相色譜儀測定啤酒的風(fēng)味物質(zhì)（高級醇類和酯類）的含量[14-15]。

1.3.7 啤酒發(fā)酵單因素試驗(yàn)

固定發(fā)酵時間為7 d，分別探究洋蔥啤酒發(fā)酵過程中 pH 值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、富黃酮提取液添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、酵母接種量（100、120、130、140、160 μL/100 mL）對富黃酮洋蔥啤酒酒精度和黃酮增長率的影響。

1.3.8 響應(yīng)面優(yōu)化

對試驗(yàn)優(yōu)選的因素采用響應(yīng)面優(yōu)化分析法，通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計[16-20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)pH值為5.0～6.0，富黃酮提取液添加量為0.5%～2.0%，酵母接種量為120μL/100 mL～160 μL/100 mL時，樣品的酒精度較佳，黃酮增長率在此范圍內(nèi)有最大值。因此，以最適發(fā)酵時間7 d為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化以確定最佳發(fā)酵條件。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.2.1 BBD試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行BBD試驗(yàn)方案設(shè)計與結(jié)果分析，結(jié)果如表1所示。以發(fā)酵液的酒精度和黃酮增長率為因變量進(jìn)行雙值響應(yīng)面分析，結(jié)果見表2。

表1 BBD因素及水平Table 1 Factors and levels of BBD

表2 BBD方案及響應(yīng)值Table 2 Scheme and response value of BBD

對得到的結(jié)果進(jìn)行擬合，分別得到酒精度（Y1）和黃酮增長率（Y2）與富黃酮提取液添加量、pH值、酵母接種量之間的二次多項回歸方程：Y1（酒精度）=4.53-0.60A-0.33B-0.059C+0.087AB-0.25AC+7.500×10-3BC+0.39A2-0.71B2+0.55C2；Y2（黃酮增長率）=40.16-0.59A-3.97B+4.25C-1.56AB-0.64AC+1.95BC-2.82A2-2.26B2-9.34C2。

對得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 BBD試驗(yàn)中酒精度和黃酮增長率二次回歸方差分析結(jié)果Table 3 Results of quadratic regression analysis of variance of alcohol content and flavonoid growth rate in BBD test

由表3可知，酒精度的回歸模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05）；黃酮增長率的回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該回歸模型與實(shí)際情況比較吻合，可用于洋蔥啤酒的制備工藝分析和預(yù)測。在回歸模型中，A、B2對于酒精度的影響極顯著，B、C2對于酒精度影響顯著；B、C、C2對于黃酮增長率的影響極顯著，在所設(shè)計的試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對酒精度的影響順序?yàn)楦稽S酮提取液添加量＞pH值＞酵母接種量，對黃酮增長率的影響順序?yàn)榻湍附臃N量＞pH值＞富黃酮提取液添加量。

2.2.2 交互項對酒精度和黃酮增長率影響

圖2為洋蔥啤酒發(fā)酵過程中pH值、富黃酮提取液添加量和酵母接種量這3個因素兩兩之間的交互作用對啤酒的酒精度和黃酮增長率的影響的三維響應(yīng)圖。

圖2 交互作用對富黃酮洋蔥啤酒中的酒精度和黃酮增長率的影響Fig.2 Effect of interaction on alcohol content and growth rate of flavonoids in flavonoid-rich onion beer

根據(jù)圖2分析可得知，當(dāng)富黃酮提取液添加量（A）、pH值（B）和酵母接種量（C）兩兩相互作用時，AC和BC的等高線的橢圓度較大，3D曲面的坡度較陡，說明AC和BC的交互作用對黃酮增長率的影響顯著，其中富黃酮提取液添加量（A）和酵母接種量（C）的交互作用對黃酮增長率的影響最大，這與回歸模型方差分析的結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)條件與驗(yàn)證

根據(jù)軟件分析可知，獲得最大黃酮增長率的優(yōu)化條件為富黃酮提取液添加量1.338%，pH5.07，酵母接種量142.68 μL/100 mL，在該條件下預(yù)測得到黃酮增長率為42.11%，酒精度為4.20%vol；獲得最佳酒精度的優(yōu)化條件為富黃酮提取液添加量1.316%，pH5.83，酵母接種量157.49 μL/100 mL，在該條件下預(yù)測得到黃酮增長率為33.99%，酒精度為4.30%vol。綜合考慮，確定最佳發(fā)酵條件為富黃酮提取液添加量1.338%，pH5.07，酵母接種量 142.68 μL/100 mL，考慮實(shí)際工藝條件，調(diào)整最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為富黃酮提取液添加量1.3%，pH5.1，酵母接種量 143 μL/100 mL，根據(jù)所選取的各個參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，在此條件下所得到的富黃酮洋蔥啤酒的黃酮增長率為41.9%，酒精度為4.30%vol，與預(yù)測值相對誤差在1%以內(nèi)，實(shí)際值與預(yù)測值擬合較為良好，具有實(shí)際參考價值。

3 結(jié)論

本文以開發(fā)洋蔥深加工產(chǎn)品為目標(biāo)，將紫皮洋蔥中的功能性物質(zhì)黃酮應(yīng)用于啤酒發(fā)酵，對富黃酮洋蔥啤酒的釀造工藝運(yùn)用單因素試驗(yàn)初步確定最適條件，然后利用響應(yīng)面法，以酒精度和黃酮增長率為響應(yīng)值，對洋蔥啤酒發(fā)酵過程中的酵母接種量、pH值、富黃酮提取液添加量進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，分別建立待優(yōu)化變量與響應(yīng)值之間的回歸模型，通過模型檢驗(yàn)與顯著性分析，確定最佳發(fā)酵條件，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。優(yōu)化結(jié)果表明富黃酮洋蔥啤酒的最佳發(fā)酵條件：100 mL麥芽汁中，富黃酮提取液添加量為1.3 mL，pH值為5.1，酵母接種量為143 μL。在此條件下，最終產(chǎn)品的酒精度為4.30%vol，黃酮增長率為41.9%。得到的洋蔥啤酒中黃酮含量較高，清澈透明，顏色偏紅，口感醇正。