蔡蕭君，江柏華，張碧海，陸振華，王 濤，李 強(qiáng)，金冠男

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150036）

肺纖維化是一種以細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積為特征的隱匿性、進(jìn)行性疾病，其導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)不可逆破壞和氣體交換功能障礙［1］。研究表明，近年肺纖維化的發(fā)病率不斷上升［2，3］。肺纖維化是肺組織異常損傷修復(fù)過程的嚴(yán)重結(jié)果。這種病理、生理失調(diào)涉及上皮損傷、氧化應(yīng)激、凝血障礙和炎癥之間復(fù)雜的相互作用，最終導(dǎo)致多種細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［4-6］。肺泡上皮細(xì)胞在遇到侵略者時(shí)，可分泌腫瘤壞死因子作為炎癥信號(hào)通路的介質(zhì)［7］，通過激活核因子轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。其中，炎癥反應(yīng)是白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞重新聚集和氧化應(yīng)激損傷加重的原因［8］。目前，吡非尼酮為臨床治療肺纖維化的代表性藥物，但常伴有一定程度的副作用，給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4，5］。因此，迫切需要新的藥物來有效治療肺纖維化。

幾千年來，中醫(yī)藥為慢性肺疾病提供了有效的治療方法，包括減輕臨床癥狀、改善肺功能和提高肺功能鍛煉能力。目前，對(duì)中藥配方和中藥單體的研究已被證明是治療肺纖維化的有效方法［9，10］。丹貝益肺方出自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，由江柏華教授自擬經(jīng)驗(yàn)而成。此方為丹參30 g、黃芪30 g、平貝20 g、黨參20 g、麥冬20 g、桔梗20 g，川芎15 g、桃仁15 g、五味子15 g、補(bǔ)骨脂15 g、地龍各15 g 組成。其對(duì)肺纖維化療效確切［11-26］。因此，本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)研究丹貝益肺方對(duì)肺纖維化大鼠的干預(yù)作用，為臨床肺纖維化發(fā)病機(jī)制和丹貝益肺方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

UHPLC-Q-Exactive 系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；TOMS 分析天平（美國(guó)固安捷公司）；ZJHK-40L 超純水機(jī)（天津卓精虹科儀器設(shè)備技術(shù)有限公司）。

丹參、平貝、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補(bǔ)骨脂、麥冬、五味子購自于哈爾濱世一堂有限公司；水合氯醛（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；谷胱甘肽試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190417）；超氧化物歧化酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190404）；丙二醛試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190401）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性清潔級(jí)SD 大鼠30 只，體重（150±20）g；黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供［動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（黑）2019-0004］；飼養(yǎng)環(huán)境［溫度（20±1）℃和濕度（50±10）%］；給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。

1.3 丹貝益肺方溶液配制

丹貝益肺方由丹參、貝母、川芎、桃仁、地龍、黃芪、黨參片、麥冬、五味子、補(bǔ)骨脂、桔梗等組成，藥物飲片由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥局提供，水煎濃縮制成生藥濃度為0.6 g/mL 的水煎液［26］，大鼠灌胃體積1 mL/100 g。

1.4 模型復(fù)制及樣本制備

30 只大鼠根據(jù)自由數(shù)列隨機(jī)分為3 組，即空白組、模型組、給藥組，每組10 只。空白組大鼠氣管內(nèi)霧化磷酸鹽緩沖液，剩下所有大鼠氣管內(nèi)霧化博萊霉素（5 mg/kg）。造模1 d 后，給藥組給予丹貝益肺方進(jìn)行干預(yù)（每天1 次），連續(xù)28 d［26］。收集實(shí)驗(yàn)第28 天夜尿，進(jìn)行離心（13 000 r/min、15 min、4℃），用于代謝組學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)第29 天，以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，各組大鼠負(fù)壓管腹主動(dòng)脈獲取血液樣本，一部分血液樣本離心（3 500 r/min、15 min、4 ℃），分離血清收集用于檢測(cè)生化指標(biāo)（MDA、GSH、SOD）。

1.5 分析條件

UHPLC-Q-Exactive 系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），柱溫25 ℃，流速0.2 mL/min，流動(dòng)相A（0.1%甲酸水），流動(dòng)相B（0.1%乙腈）。梯度洗脫條件：0～2.5 min，A：95%；2.5～4.0 min，A：95%～45%；4.0～4.5 min，A：45%～41%；4.5～5.0 min，A：41%～50%；5.0～9.5 min，A：50%～95%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Compound Discoverer 3.0 專業(yè)軟件處理尿液樣本數(shù)據(jù)，并轉(zhuǎn)換成AIA 格式，帶去MZmine 開源軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和模式識(shí)別流程。以TTEST＜0.05 且Fold change＞2 的值為差異代謝物，結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫HMDB（http：//www.HMDB.ca/）或Massbank（http：//www.massbank.jp/）對(duì)篩選的成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和結(jié)構(gòu)匹配，查詢與肺纖維化相關(guān)的物質(zhì)作為生物標(biāo)記物，通過富集分析確定代謝途徑。

2 結(jié)果

2.1 丹貝益肺方對(duì)肺纖維化大鼠生化指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激損傷是評(píng)價(jià)肺纖維化的重要指標(biāo)。丹貝益肺方對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用見表1。與空白組比較，模型組SOD、GSH 顯著降低，MDA 顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組SOD、GSH明顯增加，MDA 顯著降低（P＜0.05）。

表1 肺纖維化大鼠生化指標(biāo)結(jié)果（n=10,）Tab 1 Biochemical indexes of rats with pulmonary fibrosis（n=10,）

表1 肺纖維化大鼠生化指標(biāo)結(jié)果（n=10,）Tab 1 Biochemical indexes of rats with pulmonary fibrosis（n=10,）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，▲P＜0.05。

2.2 代謝組學(xué)研究

本研究采用最新的UHPLC-Q-Exactive 系統(tǒng)，靈敏度可到e-10，因此獲取大量數(shù)據(jù)，對(duì)組學(xué)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行潤(rùn)燥平滑、色譜峰對(duì)齊等流程，然后采用模式識(shí)別技術(shù)對(duì)海量數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，得到體現(xiàn)主要分組信息的二維數(shù)據(jù)及圖像，即主成分分析圖，見圖1。由圖1 可知，3 組數(shù)據(jù)分組明顯，給藥組處于空白組和模型組間，證明丹貝益肺方療效顯著，且質(zhì)量控制（QC）數(shù)據(jù)聚集為一起，證明穩(wěn)定性良好。

圖1 肺纖維化大鼠尿液主成分分析（PCA）得分圖Fig 1 PCA score of rats with pulmonary fibrosis

進(jìn)而采用偏最小二成判別分析（OPLS-DA），針對(duì)性地分析空白組和模型組間的差異離子，選擇S 圖和VIP 圖中遠(yuǎn)離原點(diǎn)的數(shù)據(jù)作為差異離子，進(jìn)一步進(jìn)行篩選，見圖2、3。

圖2 肺纖維化大鼠尿液OPLS-DA-VIP 分析Fig 2 Result of OPLS-DA-VIP in urine of rats with pulmonary fibrosis

圖3 肺纖維化大鼠尿液OPLS-DA-S 分析Fig 3 Result of OPLS-DA-S in urine of rats with pulmonary fibrosis

通過比對(duì)HMDB 數(shù)據(jù)庫收錄的標(biāo)準(zhǔn)品成分圖譜，鑒定肺纖維化大鼠尿液生物標(biāo)記物（表2），并通過Metaboanalyst4.0（www.metaboanalyst.ca）平臺(tái)對(duì)獲取的12 個(gè)潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行通路富集分析，生成與肺纖維化相關(guān)的代謝通路富集分析圖，見圖4 。最后，構(gòu)建基于肺纖維化大鼠尿液生物標(biāo)記物的代謝通路圖，見圖5。

表2 肺纖維化大鼠尿液生物標(biāo)志物詳表Tab 2 Biomarkers in urine of rats with pulmonary fibrosis

圖4 肺纖維化大鼠尿液代謝通路富集分析Fig 4 Enrichment analysis of metabolic pathway in urine of rats with pulmonary fibrosis

圖5 肺纖維化大鼠尿液代謝通路圖Fig 5 Metabolic pathway in urine of rats with pulmonary fibrosis

3 討論

本研究首先根據(jù)經(jīng)典的氣管內(nèi)霧化博萊霉素方法復(fù)制肺纖維化大鼠模型，肺纖維化大鼠血液生化指標(biāo)顯示發(fā)生顯著差異。給予丹貝益肺方后，大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)都有回調(diào)趨勢(shì)，并向健康大鼠代謝輪廓方向發(fā)展，證明丹貝益肺方對(duì)肺纖維化的療效顯著。進(jìn)一步采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究，確定與肺纖維化相關(guān)的12 個(gè)大鼠尿液生物標(biāo)記物，其所在代謝通路或相關(guān)代謝酶的生物學(xué)意義都證明其與肺纖維化密切相關(guān)。

精氨酸的代謝產(chǎn)物涉及多種途徑[16,17]。肌酸參與ATP 的產(chǎn)生，而鳥氨酸可以轉(zhuǎn)化為腐胺和亞精胺促進(jìn)細(xì)胞增殖。鳥氨酸也可以轉(zhuǎn)化為脯氨酸和羥脯氨酸，以形成纖維化的膠原。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，纖維化大鼠的腐胺、精氨酸和4-羥脯氨酸水平升高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)延胡索酸和天冬氨酸的水平降低，它們進(jìn)入三羧酸（TCA）循環(huán)，從而將精氨酸代謝作為回補(bǔ)途徑。

TCA 循環(huán)涉及β 氧化和糖酵解產(chǎn)生的乙酰輔酶A（在丙酮酸脫氫酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A后），并產(chǎn)生黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和NADH 作為電子傳遞鏈。因此，它是細(xì)胞能量產(chǎn)生的重要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，代謝物烏頭酸顯著增加。TCA 循環(huán)代謝物富馬酸鹽顯著減少。這可能表明肺纖維化大鼠體內(nèi)的TCA 循環(huán)下調(diào)。

谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸參與了幾種產(chǎn)生TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物的反應(yīng)。谷氨酸轉(zhuǎn)化為TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物α-酮戊二酸，而天冬氨酸轉(zhuǎn)化為TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物草酰乙酸，同時(shí)將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組大鼠相比，肺纖維化大鼠體內(nèi)天冬氨酸水平降低，谷氨酸水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，這些回補(bǔ)反應(yīng)的水平發(fā)生了改變，這可能會(huì)影響TCA 循環(huán)。同時(shí)谷氨酸也可以轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽，后者是一種抗氧化劑，與肺纖維化密切相關(guān)。與空白組大鼠相比，肺纖維化大鼠肺中谷胱甘肽增加，其氧化對(duì)應(yīng)物谷胱甘肽二硫化物水平降低，這可能反映了機(jī)體對(duì)抗肺纖維化中氧化應(yīng)激的結(jié)果。

前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)丹貝益肺方對(duì)肺纖維大鼠肺組織病理變化有明顯改善作用，能夠降低INFα、IL-6 的表達(dá)[18-20]。綜上所述，丹貝益肺方對(duì)肺纖維化大鼠有一定的治療作用，調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)及精氨酸代謝通路等可能是其治療肺纖維化的作用機(jī)制。