石涵芬，馮天意，張 雙，紀(jì)雯婷，王慶國(guó)，王雪茜

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100105；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075）

皮膚、腸道和肺部的上皮細(xì)胞長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是防止感染和物理或化學(xué)損傷的保護(hù)屏障。上皮在免疫系統(tǒng)中也起著關(guān)鍵作用。對(duì)腸道和呼吸道黏膜的研究表明，上皮細(xì)胞能夠分泌特定的細(xì)胞因子，從而將炎癥推向2 型免疫反應(yīng)。研究表明，上皮源性細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）和白細(xì)胞介素-33（IL-33）在驅(qū)動(dòng)2 型反應(yīng)中起作用［1］。在過(guò)敏性疾病中，2 型炎癥可導(dǎo)致皮膚過(guò)敏性皮炎、胃腸道食物過(guò)敏和嗜酸性食管炎，或呼吸系統(tǒng)內(nèi)的哮喘、過(guò)敏性鼻炎和慢性鼻竇炎。瘙癢反應(yīng)、黏液產(chǎn)生和支氣管收縮也可能是2 型過(guò)敏反應(yīng)的組成部分。麻芥巴布膏外用貼敷，其有效成分從皮膚吸收進(jìn)入機(jī)體，從而發(fā)揮抗炎，緩解氣道高反應(yīng)的作用。前期研究表明，麻芥巴布膏對(duì)肺部的Th2 炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用，且在生藥量等同條件下，麻芥巴布膏貼敷給藥后峰值入血量?jī)H為口服組的1/4，而改善肺功能的效果卻優(yōu)于口服組［2］。因此，其經(jīng)皮入血作用于肺僅是發(fā)揮藥效的機(jī)制之一，基于麻芥巴布膏“經(jīng)皮治肺”的特點(diǎn)，上皮細(xì)胞的免疫功能成為了筆者研究的重點(diǎn)。上皮細(xì)胞作為肺、皮膚、腸道的共性物質(zhì)基礎(chǔ)，其釋放的上皮源性細(xì)胞因子被認(rèn)為是關(guān)聯(lián)以上三個(gè)部位免疫反應(yīng)的共性因子。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)麻芥巴布膏對(duì)卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏的哮喘小鼠肺、皮膚、大腸的上皮源性細(xì)胞因子的影響，探討該方基于“肺-皮-腸”軸干預(yù)哮喘的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)8～10 周齡的雌性C57/BL6 小鼠，體重20～22 g，購(gòu)自斯貝福生物科技有限公司（中國(guó)北京，編號(hào)：SCXK 2019-0010）。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：BUCM-4-2020102202-4022）。

1.2 藥物與試劑

麻芥巴布膏的藥物組成為麻黃、白芥子、延胡索、杏仁、生姜（按照1∶1∶1∶1∶1 的比例），含生藥量25 g/片，貼敷面積為63 cm2（長(zhǎng)9 cm × 寬7 cm），換算成小鼠貼敷面積約為0.2 cm2。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，卵白蛋白（OVA）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，Imject?Alum Adjuvant 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，地塞米松磷酸鈉注射液購(gòu)自辰欣藥業(yè)股份公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H37021967），4%多聚甲醛購(gòu)自中國(guó)北京歐北生物科技有限公司，檢測(cè)免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）的ELISA 試劑盒購(gòu)自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。Hipure Unviersal RNA 試劑盒購(gòu)自中國(guó)廣州美基生物科技有限公司，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green reagents 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，DEPC 水購(gòu)自中國(guó)碧云天生物。

1.3 器材

離心機(jī)（品牌：eppendorf，型號(hào)：5810，德國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（品牌：bio-tek，型號(hào)：CPOCH，美國(guó)），PCR 儀（牌 品：Bio-Rad，型 號(hào)：CFX96 Touch，美國(guó)），PTC-150 型PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)MJR 公司），NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)（品牌：杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：Nana 3000，中國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 OVA 哮喘模型的造模與藥物干預(yù) 小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松組、麻芥巴布膏組，每組8 只，共32 只。參照課題組前期研究造模方法構(gòu)建哮喘小鼠模型［3］：在第0、7和14 天，腹腔注射含0.05 mg OVA 和1 mg 氫氧化鋁凝膠致敏。在第15～25 天，用OVA 滴鼻（在PBS中稀釋至2.5 mg/mL，40 μL/小鼠）進(jìn)行哮喘激發(fā)。而空白對(duì)照組小鼠給予等劑量的PBS 腹腔注射和滴鼻替代致敏和激發(fā)。在實(shí)驗(yàn)的第15 天進(jìn)行干預(yù)：空白對(duì)照組和哮喘模型組無(wú)干預(yù)；地塞米松組小鼠腹膜內(nèi)注射地塞米松磷酸鈉注射液0.2 mL/只（2 mg/kg）；麻芥巴布膏組膏藥貼敷在小鼠的背部，每片膏藥貼敷24 h。10 d 后麻醉并處死小鼠，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 脾指數(shù)測(cè)定 稱(chēng)重后摘取脾臟，吸干表面液體，稱(chēng)取脾臟質(zhì)量。計(jì)算出脾指數(shù)=小鼠脾質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）［4，5］。

1.4.3 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H&E）檢測(cè)肺組織病理學(xué) 激發(fā)哮喘后24 h 內(nèi)用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注后取小鼠左肺組織，4%多聚甲醛脫水固定，石蠟包埋，切片6 μm 進(jìn)行H&E 染色，并在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)小鼠血清IgE 的含量，肺、皮、腸組織中TSLP 的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用Hipure Unviersal RNA 試劑盒收集組織中總RNA，無(wú)RNA 酶水中稀釋后逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。使用SYBR Green reagents 每個(gè)樣本重復(fù)三次檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參基 因，以目標(biāo)基因與GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的2-ΔΔCt比值分析計(jì)算各個(gè)組的表達(dá)情況。見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab 1 Primer sequences used in animal experiments

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 麻芥巴布膏對(duì)過(guò)敏性哮喘模型小鼠脾指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組相比，哮喘模型組小鼠脾指數(shù)顯著增高（P＜0.001）；與哮喘模型組比較，麻芥巴布膏組脾指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），地塞米松無(wú)明顯作用（P＞0.05），見(jiàn)表2 。

表2 實(shí)驗(yàn)各組小鼠脾指數(shù)（mg/g，n=8，）Tab 2 Spleen index in asthmatic mice（mg/g，n=8，）

表2 實(shí)驗(yàn)各組小鼠脾指數(shù)（mg/g，n=8，）Tab 2 Spleen index in asthmatic mice（mg/g，n=8，）

注：與空白對(duì)照組相比，###P＜0.001；與哮喘模型組相比，**P＜0.01 。

2.2 麻芥巴布膏對(duì)過(guò)敏性哮喘模型小鼠血清中IgE含量的影響

與空白對(duì)照組相比，哮喘模型的IgE 的含量明顯增多（P＜0.001），地塞米松和麻芥巴布膏明顯降低了IgE 的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)各組小鼠血清中IgE 的含量（μg/mL，n=4，）Tab 3 The content of IgE in the serum of asthmatic mice（μg/mL，n=4，）

表3 實(shí)驗(yàn)各組小鼠血清中IgE 的含量（μg/mL，n=4，）Tab 3 The content of IgE in the serum of asthmatic mice（μg/mL，n=4，）

注：與空白對(duì)照組相比，###P＜0.001；與哮喘模型組相比，***P＜0.001。

2.3 HE 染色觀察肺組織病理改變

如圖1 所示，哮喘模型組中肺組織有部分實(shí)質(zhì)化。隨著血管內(nèi)充血水腫，肺泡和細(xì)支氣管壁出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，支氣管壁增厚。使用麻芥巴布膏治療后，肺組織病理改變的程度明顯減輕。地塞米松組肺組織恢復(fù)良好。這些結(jié)果表明，麻芥巴布膏可以減輕OVA 引起的哮喘炎癥。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組小鼠肺組織H&E 染色結(jié)果（×200，比例尺=50 μm，n=4）Fig 1 H&E staining results of lung tissues in asthmatic mice（×200，scale bar=50 μm，n=4）

2.4 麻芥巴布膏對(duì)過(guò)敏性哮喘模型小鼠肺、皮、腸組織中TSLP 含量的影響

在肺組織中，與空白對(duì)照組相比，哮喘模型組的TSLP 含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），麻芥巴布膏降低了TSLP 的含量（P＜0.01），而地塞米松對(duì)TSLP 含量無(wú)明顯影響。在皮組織中，哮喘模型組的TSLP 與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），地塞米松和麻芥巴布膏均降低了TSLP 的含量（P＜0.01）。在腸組織中，哮喘模型組的TSLP 與空白對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異，而地塞米松和麻芥巴布膏降低了TSLP 的含量（P＜0.05），見(jiàn)表4 。

表4 實(shí)驗(yàn)各組小鼠肺、皮、腸組織中TSLP 的表達(dá)（pg/mL，n=4，）Tab 4 The expression of TSLP in the lung，skin and intestine in asthmatic mice（pg/mL，n=4，）

表4 實(shí)驗(yàn)各組小鼠肺、皮、腸組織中TSLP 的表達(dá)（pg/mL，n=4，）Tab 4 The expression of TSLP in the lung，skin and intestine in asthmatic mice（pg/mL，n=4，）

注：與空白對(duì)照組相比，#P＜0.05；與哮喘模型組相比，**P＜0.01。

如圖2 所示，在肺組織與皮組織間，實(shí)驗(yàn)各組TSLP 含量的相關(guān)性r為0.689，肺組織與腸組織間r為-0.163，皮組織和腸組織間r為0.422，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 實(shí)驗(yàn)各組小鼠肺、皮、腸組織中TSLP 的含量的相關(guān)性Fig 2 Correlation of TSLP content in the lung，skin and intestine in asthmatic mice

2.5 麻芥巴布膏對(duì)過(guò)敏性哮喘模型小鼠皮組織和腸組織中TSLP mRNA、IL-33 mRNA表達(dá)的影響

皮組織中哮喘模型組TSLPmRNA 的表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），地塞米松降低了TSLPmRNA 的表達(dá)（P＜0.05），而麻芥巴布膏增加了TSLPmRNA 表達(dá)（P＜0.05）。腸組織中哮喘模型組TSLPmRNA 的表達(dá)較空白對(duì)照組增多（P＜0.01），地塞米松組和麻芥巴布膏均可抑制TSLPmRNA 表達(dá)（P＜0.001），見(jiàn)表5。

表5 實(shí)驗(yàn)各組小鼠皮、腸組織中TSLP mRNA 的表達(dá)（n=4，）Tab 5 The expression of TSLP mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

表5 實(shí)驗(yàn)各組小鼠皮、腸組織中TSLP mRNA 的表達(dá)（n=4，）Tab 5 The expression of TSLP mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

注：與空白對(duì)照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與哮喘模型組相比，*P＜0.05，***P＜0.001。

皮組織中哮喘模型組IL-33mRNA 的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而地塞米松組和麻芥巴布膏均可抑制IL-33mRNA 表達(dá)（P＜0.01）。腸組織中哮喘模型組IL-33mRNA 的表達(dá)與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而地塞米松組和麻芥巴布膏均可抑制IL-33mRNA 表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表6 。

表6 實(shí)驗(yàn)各組小鼠皮、腸組織中IL-33 mRNA的表達(dá)（n=4，）Tab 6 The expression of IL-33 mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

表6 實(shí)驗(yàn)各組小鼠皮、腸組織中IL-33 mRNA的表達(dá)（n=4，）Tab 6 The expression of IL-33 mRNA in the skin and intestine in asthmatic mice（n=4，）

注：與空白對(duì)照組相比，##P＜0.01；與哮喘模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

“肺合皮毛”最早見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問(wèn)·五臟生成篇》說(shuō)：“肺之合皮也，其榮毛也”。肺宣發(fā)水谷精微物質(zhì)至體表以濡養(yǎng)皮毛，使其發(fā)揮正常的生理功能，如護(hù)衛(wèi)肌表，抵御外邪，司汗孔開(kāi)合，調(diào)節(jié)體溫等；同時(shí)皮毛調(diào)節(jié)汗孔也可以宣發(fā)肺氣，助肺呼吸，調(diào)節(jié)水液代謝等?！端貑?wèn)·痿論篇》：“肺主身之皮毛……故肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著則生痿躄也”?！端貑?wèn)·咳論篇》說(shuō)：“皮毛者，肺之合也，皮毛先受邪氣，邪氣以從其合也?！痹诓±砩戏闻c皮膚也會(huì)相互影響。橫斷面和縱向研究表明，過(guò)敏性疾病的發(fā)生遵循時(shí)間順序：從嬰兒時(shí)期的特應(yīng)性皮炎和食物過(guò)敏到兒童時(shí)期逐漸發(fā)展為過(guò)敏性哮喘和過(guò)敏性鼻炎。在解剖結(jié)構(gòu)上，它遵循皮膚-胃腸道-呼吸道的空間演化，這種現(xiàn)象被定義為“特應(yīng)性進(jìn)程”［6］。這些都強(qiáng)調(diào)肺與皮毛的密切關(guān)系。“肺與大腸相表里”最早出自《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞·本輸》，"肺合大腸，腸者，傳導(dǎo)之腑"，肺氣肅降，將水谷精微向下向內(nèi)布散以濡潤(rùn)其他臟腑，推動(dòng)大腸傳導(dǎo)糟粕，與大腸傳導(dǎo)之功相互為用。研究發(fā)現(xiàn)OVA 哮喘模型大鼠出現(xiàn)了腸道粘膜杯狀細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象［7］。肺與皮膚和腸道在生理與病理上都存在緊密聯(lián)系，這提示我們是否存在“肺-皮-腸”軸，使作用于某一臟腑的藥效作用進(jìn)而可以影響到軸上的其他臟腑，以發(fā)揮整體調(diào)控的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究麻芥巴布膏對(duì)“肺-皮-腸”軸共性物質(zhì)上皮源性細(xì)胞因子的影響，在揭示其“經(jīng)皮治肺”的生物基礎(chǔ)的同時(shí)，進(jìn)一步探索“肺-皮-腸”軸在疾病中的聯(lián)動(dòng)機(jī)制，為治療哮喘提供新的思路。

在皮膚、呼吸道和胃腸道中存在的上皮細(xì)胞可以保護(hù)我們免受外界傷害。上皮不僅充當(dāng)物理屏障，它還通過(guò)釋放上皮源性細(xì)胞因子對(duì)過(guò)敏原、污染或微生物等刺激作出積極反應(yīng)，從而啟動(dòng)和驅(qū)動(dòng)2 型免疫反應(yīng)。過(guò)敏性疾病中的失調(diào)上皮屏障活性增加了過(guò)敏原和微生物滲透以及隨后致敏的可能性。

TSLP 是一種由肺、皮膚和胃腸道黏膜表面的上皮細(xì)胞產(chǎn)生的警報(bào)素，在調(diào)節(jié)氣道的2 型免疫反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用。TSLP 是一種有效的先天免疫激活劑，是適應(yīng)性、過(guò)敏原特異性Th2 反應(yīng)的前體。在小鼠模型中，TSLP 通過(guò)激活常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞和第2 組固有淋巴細(xì)胞促進(jìn)2 型免疫反應(yīng)［8］。表達(dá)TSLP 受體的間質(zhì)巨噬細(xì)胞也可能傳播TSLP介導(dǎo)的急性氣道炎癥［9］。TSLP 基因變異和高水平的TSLP 表達(dá)與AD、哮喘、過(guò)敏性鼻結(jié)膜炎和EoE等特應(yīng)性疾病有關(guān)［10］。越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明TSLP可以激活感覺(jué)神經(jīng)元的一個(gè)子集，從而在AD 等過(guò)敏性疾病中驅(qū)動(dòng)瘙癢反應(yīng)［11］。角質(zhì)形成細(xì)胞中的TSLP 過(guò)度表達(dá)會(huì)加重OVA 哮喘模型小鼠的氣道炎癥［12］。最近的一項(xiàng)研究表明，當(dāng)皮膚屏障受損時(shí)，TSLP 誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞可通過(guò)IL-4 促進(jìn)皮膚表面對(duì)食物過(guò)敏原的致敏以及隨后的IgE 介導(dǎo)的食物過(guò)敏［13］。但在腸道中，TSLP 和IL-33 細(xì)胞因子似乎對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有保護(hù)作用［14］。研究表明TSLPR -/-小鼠在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中表現(xiàn)出促炎細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)和嚴(yán)重的腸道炎癥［15］。

IL-33 在早期免疫發(fā)展到特應(yīng)性疾病惡化的過(guò)程中可能發(fā)揮廣泛的作用。遺傳學(xué)研究已重復(fù)證明IL33 和IL1RL1 基因變異與人類(lèi)哮喘之間存在顯著相關(guān)性［16］。IL1RL1 基因的遺傳變異也與AD 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，IL33 和IL1RL1 基因座的遺傳變異與EoE風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［17］。與TSLP 一樣，IL-33 也被證明通過(guò)激活感覺(jué)神經(jīng)元介導(dǎo)瘙癢反應(yīng)［18］。IL-33 可能根據(jù)組織環(huán)境的變化具有不同的功能，IL-33 及其片段在乳糜瀉的病理學(xué)中加劇促炎回路和增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性［19］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脾指數(shù)、血清IgE 含量和HE 染色對(duì)OVA 誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，哮喘模型組脾指數(shù)升高，血清中的IgE 含量升高，支氣管壁增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明哮喘小鼠模型成功建立。檢測(cè)肺、皮、腸組織中各實(shí)驗(yàn)組TSLP 的含量，發(fā)現(xiàn)麻芥巴布膏可減少肺、皮、腸組織中TSLP的含量，下調(diào)皮組織中IL-33mRNA 表達(dá)以及腸組織中TSLPmRNA、IL-33mRNA 的表達(dá)，但增加了皮組織中TSLPmRNA 表達(dá)。表明麻芥巴布膏對(duì)皮膚屏障具有一定的刺激作用，增加皮膚上皮的TSLPmRNA，但不具有病理意義，不需要啟動(dòng)后續(xù)的過(guò)度免疫反應(yīng)，所以mRNA 沒(méi)有進(jìn)一步翻譯，檢測(cè)到的TSLP 含量沒(méi)有增加，反而有所下降，推測(cè)可能是由于麻芥巴布膏對(duì)“肺-皮-腸”軸的總體影響導(dǎo)致。

比較不同組織間TSLP 含量的相關(guān)性，結(jié)果顯示肺組織與皮組織間實(shí)驗(yàn)各組TSLP 含量的相關(guān)性為0.689，肺組織與腸組織間的相關(guān)性為-0.163，皮組織和腸組織間的相關(guān)性為0.422，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與非線性趨勢(shì)有關(guān)。但可以推測(cè)哮喘模型下肺組織中TSLP 的含量變化可能會(huì)對(duì)皮膚處產(chǎn)生一定影響，而對(duì)腸組織處的影響不明顯，可能與TSLP 在腸道有抑炎作用有關(guān)。皮TSLP 與腸TSLP 的含量變化趨勢(shì)相關(guān)可能與麻芥巴布膏均降低皮與腸TSLP 含量的作用有關(guān)。

總而言之，麻芥巴布膏可以通過(guò)影響“肺-皮-腸”上皮產(chǎn)生的TSLP，降低IL-33 的表達(dá)起到緩解哮喘的作用，為“肺合皮毛”、“肺與大腸相表里”的現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵提供了一定的思路。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

石涵芬：指標(biāo)檢測(cè)及論文撰寫(xiě)；馮天意：動(dòng)物造模及藥物干預(yù)；張雙：數(shù)據(jù)分析；紀(jì)雯婷：數(shù)據(jù)分析；王慶國(guó)：課題設(shè)計(jì)；王雪茜：課題設(shè)計(jì)及校審。