孫起超，白皓天，李婭蘭，孟健男，郭雨薇，王 銳

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

siRNA，是雙RNA 分子類，又稱為小干擾RNA。小干擾RNA 是一種雙鏈小RNA 分子，由dsDNA 通過加工而成。Dicer 酶可以識別dsRNA并將其解包裝在siRNA 中，這是一定長度和結構的RNA，即siRNA［1-3］。siRNA 具有細胞分子量大、轉染效率低、細胞靶向性差、且在人體血液組織或者人體細胞質中大量存在時容易被人體腎小球濾過和人體內源酶所抑制降解，甚至可能會產生強烈的皮膚炎癥反應以及較低的生物利用率等缺點［4，5］。蛇床子素是中藥蛇床子中的一種脂溶性成分，研究證實其具有一定調節(jié)免疫和抑制腫瘤生長的作用［6］。陽離子脂質體對于siRNA 的細胞包封率相對較高，具有良好的細胞防御陰離子的能力和較強的細胞血清化學穩(wěn)定性［7，8］。陽離子脂質體在體內可以減少藥物毒性的同時也有細胞親和性和靶向性。脂質體還能同時裝載水溶性物質和脂溶性物質［9］，由于siRNA 為水溶性物質，蛇床子素為脂溶性物質，利用陽離子脂質體這一優(yōu)點，可以制備載siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒。本文利用陽離子脂質體可以同時裝載脂溶性和水溶性成分的特性，采用薄膜分散法制備了載Survivin-siRNA 和蛇床子素陽離子脂質體納米粒，采用單因素和正交實驗法對其制備工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

旋轉蒸發(fā)儀OSB-2200（日本EYELA 株式社會），超聲細胞破碎儀（美國SONICS 公司），酶聯(lián)免疫檢測儀SYNERGY H1（美國伯騰儀器有限公司），電位粒徑儀Nano-ZS90（英國馬爾文公司）。

DOTAP（上海斯信生物有限公司，批號：RD-01173），膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130618），透明質酸（上海源葉生物科技有限公司，批號：H02N8J47121），魚精蛋白（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z31O8H47046），siRNA/FAM-siRNA（蘇州吉瑪基因股份有限公司），DEPC（北京博奧拓達科技有限公司，CAS：1609-47-8），DSPE-PEG2000（上海源葉生物科技有限公司，批號：P31M8S32960）。蛇床子素（西安綠天生物技術有限公司）性狀：白色精細粉末，水分：≤1.00%，重金屬：≤10 ppm，砷鹽：≤2 ppm，含量：≥98.0%。本品按《中國藥典》2020 版附錄有關項目檢驗方法。符合規(guī)定，可供藥用。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 0.1%DEPC 水：取去離子水1 000 mL，精確加入DEPC 1 mL，保鮮膜密封瓶口，磁力攪拌過夜，配置成0.1% DEPC 水。200 μg/mL 魚精蛋白：精確稱取魚精蛋白2 mg，放入處理過的10 mL容量瓶中，加入0.1%DEPC 水溶解定容。200 μg/mL透明質酸：精確稱取透明質酸2 mg，放入處理過的10 mL 容量瓶中，加入0.1%DEPC 水溶解定容。10 mg/mL DSPE-PEG 2000：精確稱取二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（LDSPE-PEG 2000）50 mg，放入處理過的5 mL 容量瓶中，加入0.1% DEPC 水溶解定容。

1.2.2 制備工藝 稱取處方量的DOTAP 和膽固醇于100 mL 圓底燒瓶中，加入合適的氯仿溶解。待溶化完全，置于旋轉蒸發(fā)儀上除去有機溶劑，直至脂質體在容器壁上形成一層薄膜。放置于真空干燥箱內完全除去有機溶劑。加入適量的0.1% DEPC水洗下薄膜。超聲處理30 min，加入處方量蛇床子素，再按處方所需時間進行超聲處理，細胞破碎儀下超聲60 s，再緩慢過0.45 μm 微孔濾膜，重復過濾5～10 次，得到乳白色均勻混懸液。將載SurvivinsiRNA 從冰箱中取出，4 000 r/min 離心1 min，加入適量0.1% DEPC 水震蕩充分溶解均勻。將siRNA溶液與等體積的透明質酸混合，震蕩均勻，加入適量的魚精蛋白，室溫靜置10 min 后，即制成HA-siRNA-魚精蛋白復合物。將配置好的飽和蛇床子素的陽離子脂質體與HA-siRNA-魚精蛋白復合物充分混合，室溫靜置10 min，加入適量的DSPE-PEG 2000，在50 ℃的水浴鍋中放置10 min。即制成載Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒。

1.2.3 單因素考察實驗

1.2.3.1 考察膜材比對包封率的影響 固定其他條件不變，使得DOTAP 與膽固醇的質量比為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按照“1.2.2”項下制備載蛇床子素脂質體，考察脂質體包封率的變化。

1.2.3.2 考察藥脂比對包封率的影響 固定其他條件不變，制備蛇床子素與脂質體的質量比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 時，按照“1.2.2”項下制備載蛇床子素脂質體，考察脂質體包封率的變化。

1.2.3.3 考察超聲時間對包封率的影響 固定其他條件不變，改變超聲時間分別為40、50、60、70、80 min，按照“1.2.2 項下”制備載蛇床子素脂質體，考察脂質體包封率的變化。

1.2.3.4 考察旋蒸溫度對包封率的影響 固定其他條件不變，改變旋蒸溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，按照“1.2.2”項下制備載蛇床子素脂質體，考察脂質體包封率的變化。

1.2.4 正交實驗法優(yōu)化蛇床子素脂質體處方工藝根據單因素實驗分析結果旋蒸溫度對蛇床子脂質體包封率的影響不顯著（P＞0.05），因此以單因素考察實驗為依據，設定膜材比（A）、藥脂比（B）、超聲時間（C）為考察因素，以蛇床子素包封率（Y）為評價指標，采用L9（34）正交實驗表，每個因素設置3 個水平。分別用代碼1、2、3 表示，實驗因素與水平安排見表1。

表1 正交實驗法的因素水平表Tab 1 Factor level table of orthogonal experiment

1.2.5 HA-siRNA 與魚精蛋白體積比考察 按照HA-siRNA 與魚精蛋白的體積比為0.80∶1.00、0.85∶1.00、0.9∶1.00、0.95∶1.00、1.00∶1.00、1.05∶1.00 的比例，量取相應的HA-siRNA 和魚精蛋白，分別加入到預先標記好的離心管中振蕩混勻，在室溫下放置10 min，通過電位粒徑儀測定各復合物的粒徑和Zeta 電位。

1.2.6 HA-siRNA-魚精蛋白復合物與脂質體比例考察 取無酶原離心管，分別加入含有25 μg Survivin-siRNA 的HA-siRNA-魚精蛋白復合物并進行標記，按照標記分別加入10、20、30、40、50、60、70 μL 的陽離子脂質體，將HA-siRNA-魚精蛋白復合物與已配置好的陽離子脂質體均勻混合，在室溫下靜置10 min，通過電位粒徑儀測定所得脂質體納米粒的粒徑和電位大小。

1.2.7 脂質體納米粒包封率測定方法的建立1.2.7.1 標準曲線的建立 將熒光標記的SurvivinsiRNA（FAM-Survivin-siRNA）溶解在適量的0.1% DEPC 水中制備成FAM-siRNA 儲備溶液。取0.1% DEPC 水將儲備液分別稀釋成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg/μL 不同濃度梯度的標準溶液。在492 nm 條件下，通過酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組吸光度值。

1.2.7.2 精密度試驗 按照最佳工藝條件下制備FAM-Survivin-siRNA 溶液，在492 nm 條件下測定吸光度值，平行測定5 次，記錄吸光度值。

1.2.7.3 重復性試驗 按照最佳工藝條件下制備6 份共載FAM-Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒溶液，在492 nm 條件下分別于0、15、30、45、60、75 min 時測定，記錄吸光度值。

1.2.7.4 加樣回收率試驗 按照最佳工藝條件下制備已知濃度的6 份共載FAM-Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒溶液，分別加入標樣，按“1.2.7.1”項下測定吸光度值，計算FAM-SurvivinsiRNA 濃度，計算樣品加樣回收率。

1.2.7.5 含量測定 按照最佳工藝條件下制備共載FAM-Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒。取適量的溶液進行離心，取上清液，在492 nm條件下，采用多功能酶標儀測定吸光度值，根據標準曲線計算出游離FAM-Survivin-siRNA 濃度，記為C。

載藥量計算公式：載藥量=微粒制劑中所含有的藥物÷微粒制劑的總量×100%

包封率計算公式：EE（%）=（M-C×V）÷M×100%。其中EE 是包封率，V 是樣品體積，M 是溶液中總的FAM-Survivin-siRNA 的含量。

2 結果

2.1 膜材比對包封率的影響

膜材比在5∶1 至3∶1 的范圍內隨比例降低而升高。但隨后又進而降低，見表2。膜材比為4∶1、3∶1、2∶1 時脂質體的包封率較高，故選取4∶1、3∶1、2∶1 為膜材比的3 個水平。

表2 膜材比對包封率的影響（）Tab 2 Influence of film to material ratio on encapsulation rate（）

表2 膜材比對包封率的影響（）Tab 2 Influence of film to material ratio on encapsulation rate（）

2.2 藥脂比對包封率的影響

藥脂比越大，包封率越大；反之，包封率越小，見表3。綜合考慮載藥量以及包封率兩種指標，選擇1∶4、1∶5、1∶6 為藥脂比的3 個水平。

表3 藥脂比對包封率的影響（）Tab 3 Influence of drug to lipid ratio on encapsulation rate（）

表3 藥脂比對包封率的影響（）Tab 3 Influence of drug to lipid ratio on encapsulation rate（）

2.3 超聲時間對包封率的影響

當超聲時間在40～60 min 內，包封率隨時間的增大而增大。60 min 后包封率逐漸降低，見表4。超聲時間為50、60、70 min 時脂質體的包封率較高，故選擇50、60、70 min 為超聲時間。

表4 超聲時間對包封率的影響（）Tab 4 Influence of ultrasonic time on encapsulation rate（）

表4 超聲時間對包封率的影響（）Tab 4 Influence of ultrasonic time on encapsulation rate（）

2.4 旋蒸溫度對包封率的影響

旋蒸溫度在達到30 ℃之前，包封率隨溫度的升高而上升，30 ℃后包封率隨溫度的升高而降低，見表5。旋蒸溫度為20、30、40 ℃時脂質體的包封率較高，在30 ℃時包封率最高，故選擇30 ℃為最佳的旋蒸溫度。

表5 旋蒸溫度對包封率的影響（）Tab 5 Influence of rotary steam temperature on encapsulation rate（）

表5 旋蒸溫度對包封率的影響（）Tab 5 Influence of rotary steam temperature on encapsulation rate（）

2.5 正交實驗結果分析

正交實驗設計結果和方差分析分別見表6 和表7，由表6 可得，C 的極差R 最大，其次是B、A。由于因素的極差越大，對包封率的影響程度就越高，因此A、B、C 3 個因素對包封率影響的大小依次為：C＞B＞A，即超聲時間＞膜材比＞藥脂比。從各因素水平看（K 值分析），A 因素為K2＞K1＞K3，B 因素為K2＞K1＞K3，C 因素為K3＞K1＞K2。由表3 方差結果分析顯示，A、B、C 都對包封率有一定影響，其中C 對包封率有顯著影響。由上述分析可以確定的最優(yōu)方案為：膜材比為3∶1，藥脂比為1∶5，超聲時間為70 min。

表6 正交實驗安排結果Tab 6 Arrangement results of orthogonal experiment

表7 方差結果分析Tab 7 Analysis of variance results

2.6 HA-siRNA 與魚精蛋白的體積比例

當HA-siRNA-魚精蛋白體積比為0.9 時，復合材料粒徑最大，一般為中性。隨著HA-siRNA 比重的增加，復合物的粒徑和Zeta 電位迅速減小，見表8。因此，筆者認為1.0 是HA-siRNA 和魚精蛋白的最佳體積比，在這個比例下，復合物是一個小的負電荷粒子。

表8 HA-siRNA 與魚精蛋白復合物的粒徑和電位Tab 8 Size and potential of HA-siRNA and protamine complexes

2.7 HA-siRNA-魚精蛋白復合物與脂質體的比

隨著脂質體量的增加，總粒徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而Zeta 電位則持續(xù)增大。50 μL 為最佳陽離子脂質體合成量；合成的納米顆粒粒徑為127.1 nm，Zeta 電位為43 mV，見表9。

表9 HA-siRNA-魚精蛋白復合物與不同量脂質體結合的粒徑和電位Tab 9 Size and potential of HA-siRNA-protamine complex binding with different amounts of liposomes

2.8 最佳工藝

采用薄膜分散法，稱取DOTAP 與膽固醇的質量比為3∶1，加入到圓底燒瓶中加入適量的三氯甲烷，30 ℃旋蒸直到瓶底形成一側脂質體薄膜，真空干燥2 h 除去有機溶劑，加入10 mL 去離子水，超聲處理30 min，按照蛇床子素與脂質體的比為1∶5，加入處方量的蛇床子素，超聲70 min，得到乳白色載蛇床子素脂質體。

取凍存的S urvivin-siRNA，4 000 r/min 離心1 min，加入DEPC 水震蕩搖晃使其溶解。取含有25 μg Survivin-siRNA 的溶液加入等質量的透明質酸溶液混合，室溫靜置10 min 形成HA-siRNA。以HA-siRNA 與魚精蛋白的體積比為1∶1 進行混合，室溫靜置10 min，形成HA-siRNA 魚精蛋白復合物。在配置好的H A-siR N A 魚精蛋白復合物中加入50 μL 的載蛇床子素脂質體，室溫靜置10 min。加入50 μL DSPE-PEG 2000，在50 ℃水浴鍋中靜置10 min。載Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒制備完成。

2.9 最佳工藝驗證

按照正交實驗法挑選出最佳的載蛇床子素脂質體的制備工藝，按照最佳工藝制備平行三次測定包封率，并將實測值與預測值進行比較，計算兩值之間的誤差。實驗結果見表10。

表10 驗證實驗結果表Tab 10 Verification experimental results

結果分析：載蛇床子素脂質體包封率的預測值與實際值的相對偏差小于5%，證明該工藝準確可靠，重復性良好，正交實驗所建立的方法預測性良好。

2.9.1 脂質體納米粒的表征

2.9.1.1 脂質體納米粒的電位與粒徑 按照最佳工藝條件下制備的載Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒樣品，分別取適量樣品加入比色皿和樣品池中，用電位粒徑儀測定粒徑和電位。通過最佳工藝進行5 次測定，制得的載S urvivin-siRN A 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒的粒徑為（132.3±0.2）nm，電位為（43.15±0.05）mV。

2.9.1.2 透射電鏡觀察脂質體納米粒的外觀 按照“2.8 項下”最佳工藝制備共載Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒，取5 μL 滴加在銅網上，室溫靜置至干燥。將銅網置于透射電鏡下觀察脂質體的形態(tài)。觀察結果見圖1。如圖所示，共載Survivin-siRNA+蛇床子素陽離子脂質體納米粒呈不規(guī)則的類圓形。

圖1 脂質體透射電鏡圖Fig 1 Transmission electron microscopy of liposomes

2.9.2 脂質體納米粒包封率的檢測

2.9.2.1 標準曲線的制作 按“1.2.7.1”項下方法，以吸光度為縱坐標，F(xiàn)AM-Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒溶液為橫坐標，建立標準曲線，結果見表11、圖2。

表11 不同濃度標準溶液吸光度值Tab 11 Absorbance values of standard solutions of different concentrations

圖2 標準曲線Fig 2 Standard curve

繪制成吸光度（Y）對于FAM-Survivin-siRNA濃度（X）的標準曲線，得到標準曲線方程：Y=989.18X+124.52（R2=0.999 1）。結果表明，吸光度與FAM-Survivin-siRNA 濃度在0.05～0.30 μg/μL 范圍內呈良好的線性關系。

2.9.2.2 精密度試驗結果 按照“1.2.7.1”項下方法制備FAM-Survivin-siRNA 溶液，“1.2.7.2”項下方法在492 nm 條件下測定吸光度值，平行測定5 次，結果RSD=1.28%（n=5），結果表明精密度良好。

2.9.2.3 重復性試驗結果 按照最佳工藝條件下方法制備6 份共載FAM-Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒溶液，“1.2.7.3”項下方法在492 nm 條件下測定吸光度值，結果RSD=1.80%，表明重復性良好。

2.9.2.4 加樣回收率試驗結果 按“1.2.7.1”項下測定吸光度值，“1.2.7.4”項下計算FAM-Survivin-siRNA濃度，試驗所得平均回收率為97.09%，RSD 值為1.58%，表明該方法準確度良好。

2.9.2.5 含量測定結果 按“1.2.7.5”項下方法進行檢測，檢測結果見表13。

表12 加樣回收率測定結果Tab 12 Determination results of recovery of added sample

表13 載Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒包封率Tab 13 Encapsulation rate of Survivin-siRNA and osthol cationic liposome nanoparticles

根據測定結果計算得，載FAM-Survivin-siRNA 與蛇床子素陽離子脂質體納米粒的包封率為（81.34±0.04）%，證明Survivin-siRNA 在脂質體中具有較好的包封率。

3 討論

陽離子脂質體是被廣泛使用的一種非病毒載體，具有磷脂雙分子層結構，由于細胞膜帶負電，陽離子脂質體與細胞膜有較強的親和力，利于陽離子脂質體進入細胞內進行藥物運輸。制備脂質體常用的薄膜分散法［10，11］，它主要是將磷脂和膽固醇等成膜材料直接溶于少量有機溶劑，真空旋蒸除去多余的有機溶劑至圓底燒瓶底部形成一層脂質體分散薄膜，使用蒸餾水和其他介質加熱水化脂質體分散薄膜，得大單室的脂質體，再經超聲可得不同粒徑的脂質體［12］。它具有制備簡單、包封率較高等優(yōu)點。在制備脂質體時注意，為防止siRNA 酶解，需要將所用的實驗器材用0.1% DEPC 水進行過夜浸泡，并進行高溫滅菌后使用。采用電荷自主裝原理，將帶負電荷的siRNA 與帶正電荷的陽離子脂質體通過電負荷的作用結合在一起，但是siRNA 的分子量太小，當其單獨與陽離子脂質體結合時會不穩(wěn)定的產生聚合作用。因此，選擇透明質酸與siRNA形成帶負電的共軛物在與帶正電荷的魚精蛋白通過電荷作用自主裝形成HA-siRNA 魚精蛋白復合物［13］。在測定載Survivin-siRNA 與蛇床子素脂質體納米粒的包封率時應注意siRNA 易降解，在使用酶標儀進行檢測時，標準液應現(xiàn)配現(xiàn)用，迅速完成。

粒徑是影響脂質體在體內被動靶向作用的重要理化因素［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，粒子粒徑在100 nm 時具有高透膜性，100～200 nm 內具有較高的透膜性，而大于500 nm 時很難透過上皮細胞膜［15-17］。Zeta 電位是用來評估脂質體穩(wěn)定性大小的重要指標之一［18-20］。通常情況下，Zeta 電位的絕對值通常大于60 mV 的這個時候脂質體處于最穩(wěn)定的狀態(tài)；Zeta電位的絕對值在30～60 mV 時比較穩(wěn)定；但是當Zeta 電位的絕對值通常低于30 mV 時，脂質體不穩(wěn)定且容易迅速發(fā)生凝聚。