韓大勇 趙旭庭 周春寶 陳章言 倪黎剛

摘??? 要：為研究姜曲海豬保種群線粒體DNA遺傳多樣性及種質(zhì)特性，選取姜曲海豬保種群中58個(gè)體進(jìn)行mtDNA D-loop高變區(qū)序列擴(kuò)增測(cè)序，獲得的長(zhǎng)度為427 bp有效序列基因片段，然后對(duì)有效序列遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：（1）姜曲海豬的mtDNA D-loop高變區(qū)擴(kuò)增測(cè)序的有效序列基因片段中，堿基A+T含量為63.2%，G+C含量為36.8%，堿基A+T含量明顯高于G+C含量;（2）在58個(gè)序列中共有15個(gè)變異位點(diǎn)，其中T/C轉(zhuǎn)換10次、G/A轉(zhuǎn)換3次、A/T顛換1次、C/A顛換1次;（3）檢測(cè)出單倍型3個(gè)，總的單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.686和0.005 2，表明姜曲海豬種群遺傳多樣性偏低，姜曲海豬保種群母系來(lái)源單一;（4）單倍型間遺傳距離計(jì)算結(jié)果表明，種群內(nèi)3個(gè)單倍型之間的平均遺傳距離在0.003～0.005之間，單倍體間的遺傳距離較近，表明保種群近交的情況比較嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：線粒體DNA控制區(qū);遺傳多樣性;種質(zhì)資源保護(hù);姜曲海豬

中圖分類號(hào)：S828.8????? ?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.01.005

Genetic Diversity Analysis of mtDNA Partial D-loop Sequences in Jiangquhai Pig

HAN Dayong1， ZHAO Xuting1， ZHOU Chunbao1， CHEN Zhangyan2， NI Ligang1

（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou，Jiangsu 225300， China;2. Jiangsu Jiangquhai Breeding Pig Farm， Taizhou，Jiangsu 225300， China）

Abstract： In order to study the genetic diversity and germplasm characteristics of mitochondrial DNA in Jiangquhai pig conservation population， fifty-eight individuals in Jiangquhai maintenance breeding population were selected for mtDNA analysis D-loop hypervariable region sequence amplification and sequencing and an effective sequence gene fragment of 427 bp was obtained， then the genetic diversity of effective sequences was analyzed. The results showed that the content of A+T （63.2%） was significantly higher than that of G+C（36.8%） in the effective sequence gene fragment of mtDNA of Jiangquhai pig amplification and sequencing of D-loop hypervariable region. There were 15 variation sites in 58 sequences， including T/C conversion （10）， G/A conversion （3）， A/T transversion（1） and C/A transversion （1）. Three haplotypes were detected， and the total haplotype diversity and nucleotide diversity index were 0.686 and 0.005 2 respectively， indicating that the genetic diversity of Jiangquhai pig population was low， and the maternal source of Jiangquhai pig conservation population was single; Calculation of genetic distance between haplotypes showed that the average genetic distance among the three haplotypes in the population was 0.003-0.005， and the genetic distance between haplotypes was close， indicating that the inbreeding of the conservation population was serious.

Key words： mitochondrial DNA control region; genetic diversity; germplasm conservation; Jiangquhai pig

收稿日期：2021-07-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家發(fā)展和改革委員會(huì)生物育種能力建設(shè)與產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)項(xiàng)目（發(fā)改辦高技 [2014]2573號(hào)）; 姜曲海豬保種群mtDNA D-loop序列遺傳多樣性分析（YB1201）

作者簡(jiǎn)介： 韓大勇（1980—），男，甘肅民樂(lè)人，副教授，碩士，主要從事畜禽遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用方面研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：趙旭庭（1966—），男，江蘇靖江人，教授，碩士，主要從事豬品種資源開發(fā)與保護(hù)方面研究。

姜曲海豬是江蘇省的一個(gè)歷史悠久的優(yōu)良地方豬種，主產(chǎn)于江蘇省海安、泰州市姜堰區(qū)一帶，中心產(chǎn)區(qū)位于泰州、南通、揚(yáng)州三市，而以姜埝、曲塘、海安鎮(zhèn)為主要集散地，因而得名。但姜曲海豬生長(zhǎng)速度慢，瘦肉率低[1]，自我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)瘦肉型豬品種并廣泛推廣后，姜曲海豬種群數(shù)量逐年減少，目前在江蘇姜曲海種豬場(chǎng)存欄150頭左右種豬，數(shù)量較少，已進(jìn)入國(guó)家地方品種資源保護(hù)名錄。線粒體是動(dòng)物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是動(dòng)物體細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)的重要載體，其分子量小，大小為16.5 kb左右，呈共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有進(jìn)化速度快、遺傳上自主性及嚴(yán)格的母系遺傳等特性[2]。研究表明線粒體 DNA的變異主要來(lái)源于突變，此特點(diǎn)對(duì)揭示動(dòng)物群體的遺傳轉(zhuǎn)化關(guān)系比較準(zhǔn)確，在家畜種群分類、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、經(jīng)濟(jì)性狀的研究方面應(yīng)用廣泛[3-4]。D-loop為mtDNA 的控制區(qū)，為非編碼區(qū)，是mtDNA 分子內(nèi)的高變區(qū)，進(jìn)化過(guò)程中，D-loop 的堿基替換率是mtDNA 分子的其他區(qū)域的5～10 倍，通過(guò)對(duì)mtDNA的D-loop區(qū)域序列的變異情況進(jìn)行檢測(cè)，分析該區(qū)域的堿基轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入的情況，可以了解畜禽種內(nèi)和近緣種間親緣關(guān)系，同時(shí)分析種群的遺傳多樣性[5-11]。

目前，有關(guān)姜曲海豬的線粒體DNA的遺傳特性規(guī)律研究少見報(bào)導(dǎo)。本研究以江蘇姜曲海豬保種場(chǎng)保存的姜曲海豬核心種群豬只為主要對(duì)象，分析姜曲海豬保種群mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)位點(diǎn)的遺傳變異情況，評(píng)價(jià)姜曲海豬群體種質(zhì)資源特性及其遺傳多樣性，為姜曲海豬品種資源保護(hù)與開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在江蘇姜曲海種豬場(chǎng)采集58頭保種群姜曲海豬耳樣，超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取擴(kuò)增及測(cè)序

使用組織基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）提取的58頭姜曲海豬基因組DNA。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載豬的線粒體序列（AJ002189），在待擴(kuò)增區(qū)域兩端選擇保守區(qū)，利用Primer5軟件中設(shè)計(jì)如下引物：L99：5’-CCCAAAGCTGAAATTCTAA

CTAAA-3’和H（451）：5’-GGTGAGATGGCCCTGAA

GTAAG-3’，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：10×Buffer2.5 μL，dNTP （10 mmol·L-1） 2 μL，上下游引物（ 10 μmol·L-1）各2 μL，Taq DNA聚合酶0.21 μL，模板DNA100 ng，加雙蒸水至25 μL 。

PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，33個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s），72 ℃繼續(xù)延伸10 min，PCR產(chǎn)物低溫保存，送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行經(jīng)回收、純化、測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNASTAR軟件包中的Editseq 5.0程序?qū)CR擴(kuò)增序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理，然后利用Clustal（version：1.2.1）進(jìn)行比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)校對(duì)，刪除序列間隙和兩端的不確定堿基[12]。應(yīng)用DNASP 5.10分析線粒體DNA序列單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）[13]，用MEGA6軟件計(jì)算變異位點(diǎn)的確定及單倍型間的遺傳距離（p-距離模式）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜曲海豬mtDNA D-loop序列變異情況

用 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)1條450 bp左右的特異性條帶，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后測(cè)序，獲得了58個(gè)樣本的擴(kuò)增序列，去除引物序列及兩端測(cè)序可能不準(zhǔn)確區(qū)域，獲得的有效序列基因片段長(zhǎng)度為427 bp （AJ002189的第15 425～15 851 bp）。在姜曲海豬的mtDNA D-loop高變區(qū)擴(kuò)增測(cè)序的有效序列基因片段中，堿基A+T含量為63.2%，G+C含量為36.8%，A+T含量明顯高于G+C含量，與以前的研究報(bào)道線粒體控制區(qū)富含AT的結(jié)論相一致。利用Clustal軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該檢測(cè)區(qū)段，58個(gè)姜曲海豬在該區(qū)段得到3種單倍型，3個(gè)單倍型個(gè)體數(shù)相差不大，3個(gè)單倍體中有15個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（表1），表明姜曲海豬保種群?jiǎn)伪缎蛿?shù)量少，種群的遺傳多樣性不高;多態(tài)位點(diǎn)中有13個(gè)單一性可變位點(diǎn)、2個(gè)簡(jiǎn)約性變異位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比例為 3.51%;序列中轉(zhuǎn)換頻率較高，顛換發(fā)生的較少，序列中無(wú)堿基缺失和插入;其中有10次T/C轉(zhuǎn)換，3次G/A轉(zhuǎn)換、1次A/T顛換、1次C/A顛換，轉(zhuǎn)換和顛換之比為6.5∶1，顯示出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)換偏倚現(xiàn)象，這是動(dòng)物 mtDNA 的一個(gè)顯著特征。

2.2 種群遺傳多樣性

應(yīng)用DNASP 5.10軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果表明姜曲海豬58個(gè)樣本單倍型數(shù)量為3，單倍型多樣度為0.686±0.018，核苷酸多樣度（π）為 0.005 2±0.000 85。單倍型多樣性指數(shù)及核苷酸多樣性分析結(jié)果說(shuō)明姜曲海豬種群遺傳多樣性較低。 對(duì)姜曲海豬 mtDNA D-loop 區(qū)序列進(jìn)行中性檢驗(yàn)，Tajima’s D值為-0.927 55，差異不顯著（P>0.05），符合中性突變。

2.3 種內(nèi)遺傳距離

對(duì)樣本進(jìn)行基于kimura雙參數(shù)的遺傳距離計(jì)算，由表2看出，58個(gè)個(gè)體的3個(gè)單倍型之間的平均遺傳距離為0.003～0.005，其中單倍型H3與其他2個(gè)單倍型之間的距離較大，而單倍型H1、H2之間的距離比較小，總體分析，3個(gè)單倍型之間的距離不大。3 結(jié)論與討論

3.1 姜曲海豬線粒體DNA控制區(qū)的序列變異

在58個(gè)姜曲海豬個(gè)體的 mtDNA D-loop高變區(qū)427 bp的比對(duì)序列中，共得到15個(gè)變異位點(diǎn)和3種單倍型，多態(tài)性位點(diǎn)比例為3.51%。亐開興等[15]研究表明云南保山豬19個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop高變區(qū)中發(fā)現(xiàn)8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比例為1.83%;而劉益平等[14]研究表明蘇鐘豬21個(gè)個(gè)體中發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)16個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比例3.62%;彭紅元等[17]研究表明陸川豬在74個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到7個(gè)單倍體，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)變異位點(diǎn)。本研究中發(fā)現(xiàn)姜曲海豬的線粒體單倍型和多態(tài)位點(diǎn)相對(duì)較少，雖然3個(gè)單倍體的個(gè)體數(shù)量基本均衡，但還是能反映出姜曲海保種群母系來(lái)源較少，群體多樣性較低的特征。DNA 序列中有轉(zhuǎn)換和顛換2種形式的堿基替換，多數(shù)的研究結(jié)果認(rèn)為，線粒體基因組DNA發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率要遠(yuǎn)高于顛換。本研究中，姜曲海豬線粒體DNA序列發(fā)生13次堿基轉(zhuǎn)換，2次堿基顛換，轉(zhuǎn)換次數(shù)顯著高于顛換，這與其他物種有一致的結(jié)果[15]。

3.2 姜曲海豬的遺傳多樣性

衡量一個(gè)品種（群體）mt DNA變異程度的兩個(gè)重要指標(biāo)是單倍型多樣度（Hd）和核苷酸多樣度（Pi），單倍型多樣度是指樣本中隨機(jī)抽取到2個(gè)不同單倍型的頻率、核苷酸多樣度是指給定群體內(nèi)隨機(jī)選取的mtDNA 序列間的平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)目[19]。Hd和Pi值越大，群體的多態(tài)程度越高，其遺傳多樣性越豐富[20]。本研究中，姜曲海豬的核苷酸多樣性指數(shù)和單倍型多樣性指數(shù)分別為0.005 2和0.686，核苷酸多樣性指數(shù)較低，單倍型多樣性指數(shù)較高，分析其原因可能是受種群的數(shù)量對(duì)該豬遺傳多樣性的影響，雖然通過(guò)堿基突變積累了比較好的單倍型多態(tài)性，但對(duì)核苷酸序列的多樣化積累效果較少。因此姜曲海豬今后的保種工作的重點(diǎn)應(yīng)放在提高姜曲海群體核苷酸多樣性方面。

3.3 姜曲海豬群體內(nèi)3個(gè)單倍型之間遺傳距離

利用線粒體D-loop區(qū)進(jìn)行的分子遺傳距離分析是基于母系起源方面的，有別于其他技術(shù)方法計(jì)算出的遺傳距離。彭紅元等[16]研究陸川豬種群內(nèi)遺傳距離在0.003～0.005之間，各種群間的遺傳差異很小;丁玫等[18]研究白洗豬各單倍型之間遺傳距離變化范圍在0.003～0.007，各個(gè)單倍型之間的距離總也不大。本研究從線粒體層面計(jì)算的姜曲海豬各單倍型之間的遺傳距離在0.003～0.005之間，各單倍型之間的遺傳距離較小。分析產(chǎn)生這種結(jié)果的原因主要是姜曲海豬種群長(zhǎng)期獨(dú)立在保種場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行人工選擇和群內(nèi)繁殖，幾乎沒(méi)有與場(chǎng)外的交流，造成各單倍型之間的遺傳距離交小，遺傳多樣度不高。因此必須對(duì)姜曲海豬的保種方案進(jìn)行優(yōu)化和完善，提高保種群遺傳多樣性。

3.4 姜曲海豬的種質(zhì)資源保護(hù)

姜曲海長(zhǎng)期保存在一個(gè)相對(duì)閉鎖的保種場(chǎng)，近交繁殖。但受保種經(jīng)費(fèi)、技術(shù)等因素的影響，姜曲海種群數(shù)量較小，小群體繁殖所導(dǎo)致基因丟失和遺傳漂變，進(jìn)而造成姜曲海豬保種種群的遺傳多樣性較貧乏，種群的延續(xù)能力降低。因此姜曲海豬保種過(guò)程中，要加強(qiáng)姜曲海遺傳多樣性的研究，通過(guò)其他技術(shù)方法進(jìn)行主要性狀的遺傳標(biāo)記研究，建立種群的遺傳譜系，較準(zhǔn)確的進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，在選種選配過(guò)程中，讓不同單倍體群間進(jìn)行配種，促進(jìn)種群間基因交流，提高種群遺傳多樣性。

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