鄭元青 張鵬 何娟娟 付卡利 張英帥 何風(fēng)艷 牛明 龔云

〔摘要〕 目的 為大葉千斤拔藥材等級評價的修訂提供科學(xué)依據(jù)。方法 收集不同產(chǎn)地大葉千斤拔樣品30批，對其直徑、雜質(zhì)、水分、總灰、浸出物、染料木苷含量進(jìn)行測定;參照2020年版《中華人民共和國藥典》第四部通則2201及采用高效液相色譜法分別測定浸出物、染料木苷含量;運用Excel和 SPSS 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、聚類分析，結(jié)合生產(chǎn)和市場實際運用，為制訂大葉千斤拔藥材商品等級評價提供依據(jù);建立大葉千斤拔抑菌生物評價方法，并通過聚類分析和PCA分析進(jìn)行不同產(chǎn)地藥材生物活性情況分析。結(jié)果 通過相關(guān)性分析、聚類分析，篩選出直徑、浸出物、染料木苷含量3個指標(biāo)，并結(jié)合生產(chǎn)實際劃分選貨和統(tǒng)貨。生物活性評價表明不同產(chǎn)區(qū)大葉千斤拔的抑菌效果存在差異。結(jié)論 所建立的大葉千斤拔藥材商品等級劃分綜合考慮了外觀性狀和成分含量，該評價方法適合于大葉千斤拔藥材的等級判斷，為后期基于功能性成分的含量和生物活性評價制訂更加全面合理的大葉千斤拔藥材商品等級標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 千斤拔;等級評價;高效液相色譜法;染料木苷;生物活性評價

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.006

Study on medicinal materials grade evaluation of Moghania macrophylla

ZHENG Yuanqing1， ZHANG Peng1， HE Juanjuan1， FU Kali1， ZHANG Yingshuai1， HE Fengyan2， NIU Ming3*， GONG Yun1*

（1. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhuzhou， Hunan 412000， China; 2. National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China; 3. The Fifth Medical Center of General Hospital of PLA， Beijing 100071， China）

〔Abstract〕 Objective To provide scientific basis for institution of medicinal materials grade evaluation of Moghania macrophylla. Methods Thirty samples of Moghania macrophylla from different producing areas were collected. The diameter， impurity， moisture， total ash， extract and content of genistein were determined. Excel and SPSS statistical software were used to carry out correlation analysis and cluster analysis on the data， combined with the actual application of production and market， to provide a basis for formulating the commercial grade evaluation of Moghania macrophylla. A biological evaluation method for the antimicrobial activity of Moghania macrophylla was established， and cluster analysis and PCA analysis were carried out to analyze the biological activity of medicinal materials from different habitats. Results Through correlation analysis and cluster analysis， three indexes including diameter， extract and genistein content were screened out， and the selected goods and the unified goods were divided according to the actual production. The biological activity evaluation showed that there were differences in the bacteriostatic effects of Moghania macrophylla in different producing areas. Conclusion The established commercial grade classification of Moghania macrophylla takes comprehensive consideration of appearance and component content， and the evaluation method is suitable for grade judgment of Moghania macrophylla， and provides a basis for formulating a more comprehensive and reasonable commercial grade standard of Moghania macrophylla based on the content and biological activity evaluation of functional components.

〔Keywords〕 Moghania macrophylla; grade evaluation; high performance liquid chromatography; genistein; bioactivity evaluation

千斤拔始載于《植物名實圖考》，2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）收載的植物來源包含蔓性千斤拔Moghania. philippinessis （Merr. et Rolfe） Li.、大葉千斤拔 Moghania. macrophylla （Willd.） O. Kuntze 和繡毛千斤拔 Moghania. ferruginea （Wall. ex Benth.） Li.的干燥根[1]552，其性味甘、溫，具有祛風(fēng)濕、益脾腎、強(qiáng)筋骨的功效[2-3]。2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中收載的為千斤拔（蔓性千斤拔）的干燥根和大葉千斤拔的干燥根和莖[4]，其主要用于治療風(fēng)濕骨痛、慢性腎炎、跌打損傷和痛經(jīng)等疾病[3]。千斤拔所含化學(xué)成分以黃酮類化合物為主，包括揮發(fā)油、多糖、甾醇類、香豆素及皂苷類化合物，藥理作用豐富[5-7]。

中藥材作為特殊商品，等級不僅是評價藥材質(zhì)量的重要依據(jù)，同時還影響著藥材價格的高低。作為千金藥業(yè)自主開發(fā)并獨家生產(chǎn)的純中藥制劑婦科千金片/膠囊的君藥大葉千斤拔，目前在國內(nèi)外尚無相應(yīng)的藥材等級評價方法。本研究收集了各主產(chǎn)區(qū)的大葉千斤拔樣品30個批次，在2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》的基礎(chǔ)上修訂了薄層鑒別、新增了染料木苷含量測定方法，并依照2020年版《中華人民共和國藥典》測定所有樣品的直徑、浸出物、水分、總灰分，充分考慮藥材特性、劃分等級等關(guān)鍵影響因素，結(jié)合內(nèi)在和外在質(zhì)量指標(biāo)相關(guān)性分析、聚類分析，提出大葉千斤拔藥材等級評價方法。

生物評價技術(shù)是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，評價藥物有效性或毒性的方法，是繼性狀評價、化學(xué)評價之后推動中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)走進(jìn)臨床、關(guān)聯(lián)療效的關(guān)鍵[8-9]。婦科千金膠囊在治療盆腔炎性后遺癥領(lǐng)域有明顯優(yōu)勢，本研究通過考察其君藥大葉千斤拔抑制大腸桿菌的活性，繼而新建了生物評價方法，并基于生物活性與效應(yīng)對藥材等級評價的有效性進(jìn)行驗證。

1 試驗材料與儀器

1.1? 試驗儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）;Agilent 1260-6410B LC-MS聯(lián)用系統(tǒng)（美國安捷倫公司）;Mettler AE240、Mettler XS105DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;KQ-300DA型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz）;DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）;SX2-4-10型電阻爐（長沙市華光電爐廠）;微量量熱儀（瑞典Thermometric AB公司）。

1.2? 試劑

染料木苷對照品（批號111709-201702，含量以99.9%計）由中國食品藥品檢定研究院提供;甲醇、乙酸（分析純）、聚酰胺薄膜購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、冰醋酸（色譜純）購買于Fisher公司;水為ddH2O;大腸桿菌（ATCC：25922）購買于中國藥品生物制品檢定所;LB肉湯培養(yǎng)基購買于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3? 藥材

藥材經(jīng)千金藥業(yè)QC主管丁小明鑒定為大葉千斤拔Moghania. macrophylla （Willd.） O. Kuntze，藥用部位均為根，共30批（見表1）。

2 方法

2.1? 外觀性狀觀察與測量

按照市場劃分情況對各等級藥材采用四分法進(jìn)行取樣，用游標(biāo)卡尺分別測量不同產(chǎn)地各等級藥材的根直徑。

2.2? 雜質(zhì)

觀察每批樣品顏色、霉變情況，并參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部通則2301雜質(zhì)檢查法[1]234，用電子天平稱定每批樣品中雜質(zhì)占比，計算樣品中的雜質(zhì)含量。

2.3? 水分

參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部通則0832水分測定方法[1]114，計算樣品中水分含量。

2.4? 總灰分

參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部通則2302灰分測定方法[1]234，計算樣品中總灰分含量。

2.5? 浸出物

參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部通則2201醇溶性浸出物測定法[1]232項下熱浸法測定，用70%乙醇作溶劑，計算樣品中醇溶性浸出物含量。

2.6? 染料木苷含量測定

黃酮類成分是千斤拔的主要成分之一，也是千斤拔質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。對不同產(chǎn)地大葉千斤拔進(jìn)行染料木苷含量的測定，方法和方法學(xué)參考文獻(xiàn)[10]。

2.7? 等級數(shù)據(jù)劃分

采用Excel和 SPSS 19.0 軟件對30批大葉千斤拔藥材進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。根據(jù)相關(guān)性分析篩選出大葉千斤拔等級劃分指標(biāo);采用系統(tǒng)聚類方法對不同產(chǎn)地大葉千斤拔樣品進(jìn)行聚類分析。

2.8? 生物活性評價

大腸桿菌是慢性盆腔炎的主要致病菌之一，婦科千金膠囊可有效抑制大腸桿菌的生長。以大腸桿菌作為婦科千金膠囊直接抑菌作用的研究載體，用不同濃度的菌液做方法學(xué)考察，將供試液樣品置于相應(yīng)安瓿瓶，采用微量量熱儀在等溫條件下測定不同濃度大葉千斤拔溶液對大腸桿菌作用的生長代謝熱曲線。通過新建的大葉千斤拔抑菌生物活性評價方法，檢測婦科千金膠囊君藥大葉千斤拔對大腸桿菌的抑菌效果，并用于分析不同產(chǎn)地大葉千斤拔藥材的抑菌活性情況。

3 結(jié)果與分析

3.1? 外觀性狀

對收集到了30份樣品外觀指標(biāo)直徑進(jìn)行統(tǒng)計描述，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各產(chǎn)地大葉千斤拔平均直徑范圍1.2～3.5 cm，變異系數(shù)達(dá)到27.46%，說明不同產(chǎn)地千斤拔直徑大小存在差異。各產(chǎn)區(qū)平均直徑大小依次為云南>廣西>貴州>湖南>四川。

3.2? 雜質(zhì)

30批大葉千斤拔樣品雜質(zhì)的含量在1%～3%，平均雜質(zhì)含量為2.4%，均不超過2020年版《中華人民共和國藥典》對藥材雜質(zhì)規(guī)定的限量3%，結(jié)果見表2。各產(chǎn)區(qū)平均雜質(zhì)大小依次為四川>廣西>貴州≈湖南>云南。

3.3? 水分

30批大葉千斤拔樣品水分的含量在8.0%～9.8%，平均水分含量為8.9%，均不超過2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》對千斤拔水分規(guī)定的限量15.0%， 結(jié)果見表2。各產(chǎn)區(qū)平均水分大小依次為湖南>四川>廣西>云南>貴州。

3.4? 總灰分

30批大葉千斤拔樣品總灰分的含量在1.9%～4.9%，平均總灰分為3.4%。均不超過2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》對千斤拔總灰分規(guī)定的限量6.0%， 結(jié)果見表2。各產(chǎn)區(qū)平均總灰分大小依次為四川>廣西>湖南>云南>貴州。

3.5? 浸出物

30批大葉千斤拔醇溶性浸出物均不低于10%（2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》），結(jié)果見表2。云南栽培千斤拔樣品浸出物平均值16.8%，與其他各產(chǎn)區(qū)千斤拔樣品浸出物有差異，平均浸出物含量大小依次為云南>廣西>湖南≈四川>貴州。

3.6? 染料木苷含量

30批大葉千斤拔染料木苷含量在0.05%～0.14%，平均含量在0.08%左右，結(jié)果見表2。不同產(chǎn)地大葉千斤拔的平均染料木苷含量存在差異，大小依次為廣西>云南>貴州≈四川>湖南。

3.7? 等級分析

3.7.1? 大葉千斤拔藥材等級劃分指標(biāo)的篩選? 將篩選得到的大葉千斤拔藥材平均直徑、水分、總灰分、雜質(zhì)、浸出物及染料木苷含量6個指標(biāo)與市場商品等級進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，浸出物與染料木苷含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），含量與直徑呈顯著正相關(guān)（P<0.05），故選取浸出物、染料木苷含量和直徑作為大葉千斤拔藥材分級指標(biāo)。

3.7.2? 不同產(chǎn)地大葉千斤拔聚類分析? 采用SPSS 19.0軟件以平均直徑、浸出物、染料木苷含量為指標(biāo)，對不同產(chǎn)地大葉千斤拔樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖1和表4。結(jié)合各樣品產(chǎn)地及各指標(biāo)測定情況分析，一等品共2批，產(chǎn)地分布為云南、廣西;二等品共13批，產(chǎn)地分布為云南5批、廣西2批、湖南2批、貴州3批、四川1批。

3.8? 基于抑菌活性的大葉千斤拔質(zhì)量評價

3.8.1? 抑菌濃度考察? 大葉千斤拔供試液過0.22 μm 微孔濾膜除菌后，用LB培養(yǎng)基稀釋成濃度為32、16、8、4、2、1 mg·mL-1，按生物熱活性檢測方法，測定不同濃度藥材對大腸桿菌作用的生長代謝熱曲線。最佳濃度選擇結(jié)果見圖2，生藥量為32 mg·mL-1的曲線向右平移距離最大，說明在此濃度的藥材抑菌效果最強(qiáng)，且該濃度峰型較好，因此，選用此濃度來考察不同批次藥材的抑菌活性。

3.8.2? 不同產(chǎn)地大葉千斤拔抑菌活性考察? 采用生物熱動力學(xué)方法，考察同一濃度（生藥量32 mg·mL-1）下5個不同產(chǎn)地大葉千斤拔藥材的抑菌活性。熱譜曲線見圖3，根據(jù)熱譜曲線，提取各曲線生物熱動力學(xué)參數(shù)，詳見表5。

3.8.3? 大葉千斤拔抑菌活性分析? 以6個生物熱動力學(xué)參數(shù)細(xì)菌的第一生長期達(dá)峰時間T1、第二生長期達(dá)峰時間T2、峰值P1、峰值P2、生長速率常數(shù)k1、k2為指標(biāo)，對千斤拔藥材進(jìn)行聚類分析和PCA分析，更好地判斷其相關(guān)性和差異性。圖4表明，以上藥材被分為兩大類，廣西、貴州、云南藥材相關(guān)性較好;四川和湖南藥材相關(guān)性較好。不同產(chǎn)區(qū)千斤拔的抑菌效果存在一定差異：抑菌率范圍在61.22%～89.74%，變異系數(shù)15.3%。按照藥材產(chǎn)地大致可分為兩類，其中廣西、貴州、云南的藥材抑菌效果較好。本試驗初步嘗試對不同產(chǎn)地藥材抑菌效果進(jìn)行分析，從生物活性評價結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)藥材的抑菌效果存在差異。

4 討論

黃酮類化合物是千斤拔中所含的主要成分類型，代表性成分為染料木苷和染料木素，二者均具有較強(qiáng)的抗氧化、類激素、抗菌、抗癌和保護(hù)心血管等主要作用[11-18]。本研究共收集了30批大葉千斤拔藥材，在現(xiàn)有地方標(biāo)準(zhǔn)中優(yōu)化了以染料木苷為對照的TLC薄層鑒別方法[10]，新建了染料木苷含量測定方法，并依據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》進(jìn)行了水分、灰分以及醇溶性浸出物含量測定，初步評價了各產(chǎn)地大葉千斤拔藥材的質(zhì)量。

目前，地方標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了千斤拔的合格標(biāo)準(zhǔn)，而優(yōu)質(zhì)的中藥飲片是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中成藥的必要條件，因此，制定藥材的等級標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。本研究結(jié)合外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量采用相關(guān)性分析和系統(tǒng)聚類方法，將30批不同產(chǎn)地大葉千斤拔分為3個等級：一等、二等和統(tǒng)貨。

中藥質(zhì)量評價研究經(jīng)歷了從形態(tài)鑒別到化學(xué)成分定性及定量檢測再到全過程動態(tài)控制，從單個指標(biāo)的含量測定到基于指紋圖譜的多指標(biāo)同時測定，從基于對照品的含量測定到一測多評等變化。然而，僅基于化學(xué)基準(zhǔn)點中藥質(zhì)量控制模式存在指標(biāo)性成分難以全面反映整體質(zhì)量、與臨床有效性及安全性關(guān)聯(lián)不夠緊密[19]。研究嘗試通過新建生物抑菌活性評價方法進(jìn)行藥效評價，并與本次建立的等級劃分情況進(jìn)行對比分析，結(jié)果與劃分情況存在一定程度的相對應(yīng)：按照外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量相結(jié)合的方法，云南產(chǎn)區(qū)的大葉千斤拔全部集中在一等和二等，廣西產(chǎn)區(qū)也存在一等品，這與生物評價的方法聚類出云南、廣西、貴州相關(guān)性好的結(jié)果基本吻合;但并未完全一致，如貴州產(chǎn)區(qū)的藥材未出現(xiàn)在此次劃分的一等品種。這說明不同產(chǎn)地的大葉千斤拔在生物活性上確實存在差異，提示我們還存在等級劃分標(biāo)準(zhǔn)與生物活性評價方法有機(jī)結(jié)合的分析空間，促使我們進(jìn)一步優(yōu)化方法，完善與臨床更加緊密的指標(biāo)。本研究通過建立科學(xué)、客觀的評價方法，為后期基于功能性成分的含量和生物評價制訂更加全面合理的大葉千斤拔藥材商品等級標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，對于有效監(jiān)控藥材質(zhì)量具有現(xiàn)實意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.四部[S].北京.中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].4卷.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：474-478.

[3] 中國科學(xué)院中國植物志編委會.中國植物志[M/OL].北京：科學(xué)出版社，1995[2021-09-22].http：//www.iplant.cn/info/Flemingia%20philippinensis？t=z.

[4] 湖南省食品藥品監(jiān)督管理局.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2009：220.

[5] 李? 莉，秦民堅，張麗霞，等.千斤拔屬植物的化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24（4）：203-211.

[6] 黃艷菲，丁? 玲，李艷丹，等.三種千斤拔的化學(xué)成分預(yù)分析和薄層鑒定[J].西南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，37（4）：603-606.

[7] 喬? 雪，卓? 燊，楊子明，等.千斤拔屬植物化學(xué)成分及藥理作用的國內(nèi)外研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8（12）：1546-1550.

[8] 肖小河，王伽伯，鄢? 丹.生物評價在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化中的研究與應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（3）：514-518.

[9] 張? 萌，封? 亮，賈曉斌.基于生物活性與效應(yīng)基準(zhǔn)的中藥質(zhì)量評價技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與展望[J].世界中醫(yī)藥，2020，15（15）：2234-2239.

[10] 鄭元青，何風(fēng)艷，張? 鵬，等.大葉千斤拔的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中南藥學(xué)，2021，19（7）：1425-1429.

[11] 翁春艷，楊? 艷，李曉波.染料木素抗動脈粥樣硬化的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥指南，2016，14（7）：33-35.

[12] 李朋收，劉洋洋，范冰舵，等.鷹嘴豆化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（11）：235-238.

[13] 張泉洋，馬富超，王? 帥，等.染料木苷藥理作用的研究進(jìn)展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2017，44（4）：315-318，325.

[14] ZHU Y Y， YAO Y， SHI Z X， et al. Synergistic effect of bioactive anticarcinogens from soybean on anti-proliferative activity in MDA-MB-231 and MCF-7 human breast cancer cells in vitro[J]. Molecules， 2018， 23（7）： 1557.

[15] YANAGIHARA K， ITO A， TOGE T， et al. Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer cell lines established from the gastrointestinal tract[J]. Cancer Research， 1993， 53（23）： 5815-5821.

[16] KATO K， TAKAHASHI S， CUI L， et al. Suppressive effects of dietary genistin and daidzin on rat prostate carcinogenesis[J]. Japanese Journal of Cancer Research， 2000， 91（8）： 786-791.

[17] RUIZ-LARREA M B， MOHAN A R， PAGANGA G， et al. Antioxidant activity of phytoestrogenic isoflavones[J]. Free Radical Research， 1997， 26（1）： 63-70.

[18] LEE C H， YANG L， XU J Z， et al. Relative antioxidant activity of soybean isoflavones and their glycosides[J]. Food Chemistry， 2005， 90（4）： 735-741.

[19] 葉? 霽，李睿旻，曾華武，等.基于整體觀中藥質(zhì)量標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展[J].中草藥，2019，50（19）：4529-4537.