白璐 郭靜 伍實花 趙毅 吳夢瑤 陳燦 龔云 李春 張鵬

〔摘要〕 目的 提升金櫻根藥材的質(zhì)量控制方法，對其進行安全性分析與等級評價。方法 對現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行總結(jié)，改進薄層鑒別方法，建立特征圖譜，并對含量測定方法進行研究;采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定其鉛、鎘、砷、汞、銅的殘留量;利用SPSS統(tǒng)計軟件對其進行聚類分析。結(jié)果 TLC鑒別方法各斑點清晰，分離度良好，可以區(qū)分真?zhèn)?，建立的特征圖譜有5個特征峰，指認1個特征峰;不同產(chǎn)地金櫻根5種重金屬平均含量分別為鉛0.7 mg/kg、鎘0.1 mg/kg、砷0.1 mg/kg、銅5.0 mg/kg，汞低于0.01 mg/kg;30批樣品分為3類：1批特級，9批優(yōu)質(zhì)，20批合格。結(jié)論 本方法結(jié)果準(zhǔn)確、簡便、客觀、重復(fù)性好，可用于藥材的質(zhì)量控制;不同產(chǎn)地重金屬含量均在中國《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定范圍內(nèi)，處于安全水平;本研究所提出的3個等級規(guī)格藥材的不同等級特性區(qū)分明顯，實踐中容易掌握，對藥材的采收加工、銷售流通及臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)和實踐意義。

〔關(guān)鍵詞〕 金櫻根;薄層色譜;特征圖譜;含量測定;安全性評價;等級評價

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.007

Improvement of quality control method and establishment of grade evaluation

system for Rose cymosa

BAI Lu1， GUO Jing1， WU Shihua1， ZHAO Yi1， WU Mengyao1， CHEN Can1， GONG Yun1， LI Chun2， ZHANG Peng1*

（1. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhuzhou， Hunan 412007， China; 2. Institute of Chinese

Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

〔Abstract〕 Objective To improve the quality control method of Rose cymosa， and to carry out safety evalution and grade evaluation. Methods The statutory standard of Rose cymosa were summarized. The thin-layer chromatography （TLC） identification method was improved， the characteristic map was established， and the content determination method was studied. The residues of lead， cadmium， arsenic， mercury and copper in Rose cymosa were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）. Cluster analysis of Rose cymosa was carried out using SPSS statistical software. Results The spots on TLC plate were clear and well-separated， which can be used to identify the authenticity. The established characteristic spectrum identified 5 characteristic peaks and identified 1 components. The average content of lead， cadmium， arsenic and copper was 0.7， 0.1， 0.1， 5.0 mg/kg， respectively， and mercury was less than 0.01 mg/kg. The 30 batches of samples were divided into 3 categories， 1 batch of super grade， 9 batches of high quality and 20 batches of qualified. Conclusion The proposed methods are accurate， simple， and objective， and can be used for quality control of Rose cymosa. The content of heavy metals in Rose cymosa from different areas was all within the limit prescribed in China’s Green Thade Standards Importing & Exporting Medicinal plants & Preparation， which was at a safe level. This research proposes three ranks of medicinal materials specifications for different features to distinguish clearly， and easy to master in practice， which has certain guidance and practical significance for the collection， processing， sales， circulation and clinical application of medicinal materials.

〔Keywords〕 Rose cymosa; thin-layer chromatography; characteristic spectrum; content determination; safety evaluation; grade evaluation

金櫻根為我國西南瑤族、苗族、壯藥、土家族等多個少數(shù)民族的常用藥材[1-5]，應(yīng)用廣泛，具有清熱利濕、解毒消腫、活血止血、收斂固澀的功效。本品為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michaux、小果薔薇Rosa cymosa Tratt.和粉團薔薇R. multiflora var. cathayenisis Rehder & E. H. Wilson的干燥根和莖[6]。金櫻根中主要含有三萜、黃酮、鞣質(zhì)類成分，可治療遺精、遺尿、痢疾泄瀉、崩漏帶下、子宮脫垂、痔瘡、燙傷等，為婦科千金片、金雞膠囊及廣東涼茶等常用中藥[7-9]。

金櫻根的不同現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)來源基本一致，僅湖南省和廣西省標(biāo)準(zhǔn)收載了3個基原，藥用部位分別為根及莖與根及根莖。其余地方標(biāo)準(zhǔn)僅收載了薔薇科植物金櫻子的干燥根一個來源，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別與以金櫻根對照藥材為對照的薄層色譜鑒別。本研究從定性、定量和安全性等方面全面提升了金櫻根的質(zhì)控方法，為金櫻根的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1? 主要儀器

ATS 4薄層色譜全自動點樣儀（瑞士CAMAG公司）;ADC 2薄層色譜全自動展開儀（瑞士CAMAG公司）;Derivatizer薄層色譜全自動噴霧系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）;Visualizer 2薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）;TH-II薄層色譜顯色加熱器（上?？普苌萍加邢薰荆?Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA檢測器（美國Waters公司）;iCAP RQ ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）;AB204-S電子天平、AB135-S電子天平（瑞士梅特勒公司）;KQ300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;A11分析型研磨儀（德國IKA公司）。

1.2? 試藥

金櫻根對照藥材（批號：12115-201306）購于中國食品藥品檢定研究院;薔薇酸（Y-176-180516）購于成都瑞芬思生物科技有限公司;乙醇（批號：P1433419）、甲醇（批號：P1441123）、二氯甲烷（批號：P1454839）均購于General-Reagent公司;乙腈（批號：177798）購于Fisher公司;磷酸（批號20171008）購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其他所用試劑均為分析純。金櫻根藥材為株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供，共計30份，其標(biāo)準(zhǔn)收載情況及實驗樣品信息見表1和表2。

2 方法與結(jié)果

2.1? 薄層鑒別

2.1.1? 供試品溶液的制備? 取本品粉末（過二號篩）1 g，置具塞錐形瓶，加95%乙醇10 mL，密閉，超聲處理15 min，過濾，濾液作為供試品溶液。

2.1.2? 對照品溶液的制備? 取金櫻根對照藥材，同法制成對照藥材溶液。取薔薇酸對照品適量，加二氯甲烷-甲醇（1∶1）制成1 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3? 薄層色譜? 依據(jù)薄層色譜法（中華人民共和國藥典2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取對照品溶液1 μL、供試品溶液3 μL、對照藥材溶液3 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶水（9∶1∶0.1）為展開劑，展開劑蒸汽飽和20 min后展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇（m/V），在105 ℃加熱5 min，在365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。采用上述色譜法對24批不同產(chǎn)地（S1～S20）不同基原（S31～S33）和偽品（S35）藥材進行薄層鑒別，結(jié)果樣品中斑點清晰，比移值（Rf）合適，不同基原樣品具有良好的一致性，可以達到區(qū)分偽品的目的。結(jié)果見圖1。

2.2? 特征圖譜與含量測定

2.2.1? 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性? 分別選用ACE Excel 3 C18-PFP色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）、Waters Xselect HSS PFP（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（C）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，5% A，15%～23% B，80%～72% C;10～23 min，5%A， 23% B，72% C;23～55 min，5%A， 23%～35% B，72%～60% C;55～62 min，5%A， 35%～39% B，60%～56%C;62～65 min，5% A， 39%～43% B，56%～52% C;65～80 min，5% A， 43%～55% B，52%～40% C;80～90 min，5% A， 55%～70% B，40%～25% C）;體積流量為1.0 mL·min-1;柱溫為 30 ℃;檢測波長為210 nm;進樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按薔薇酸計算應(yīng)不低于5000。供試品色譜中共呈現(xiàn)5個特征峰，與參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍以內(nèi)。規(guī)定值為0.37（峰1）、0.43（峰2）、0.67（峰3）、1.00（峰4/S）、1.02（峰5）。檢測結(jié)果與圖譜見表3-4，圖2。

2.2.2? 參照物溶液的制備? 取薔薇酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 mL含薔薇酸0.15 mg溶液，即得。

2.2.3? 供試品溶液的制備? 取金櫻根樣品（批號S32、S33、S34），粉碎，過三號篩，約1.0 g，精密稱定，置125 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對金櫻根缺少成分質(zhì)控，僅以薄層鑒別作為定性鑒別，有學(xué)者采用ACE Excel 3 C18-PFP色譜柱建立了基于同一色譜條件的金櫻根指紋圖譜和含量測定[15]，但專屬色譜柱耐用性窄，且實測過程中柱壓過高，此次采用其他廠家色譜柱進行試驗，擴充了色譜柱耐用性，新增了特征圖譜檢測，結(jié)果顯示色譜柱耐用性良好，可提高檢測效率，節(jié)約質(zhì)量控制成本。

2.3? 樣品測定

取30批金櫻根藥材，按照藥典通則及上述特征圖譜和含量測定方法進行檢測，結(jié)果如下表5-7。

結(jié)果顯示，30批金櫻根重金屬及有害元素的含量中鉛的含量在0.2～1.8 mg/kg、鎘的含量在0.03～0.3 mg/kg、砷的含量在0.03～0.3 mg/kg、銅的含量在2.2～7.3 mg/kg、汞的含量均未超過0.01 mg/kg。均在中國《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[16]規(guī)定限度內(nèi)，處于安全水平。

薔薇酸是金櫻根的有效成分之一，也是金櫻根質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。通過對不同產(chǎn)地金櫻根進行薔薇酸的含量測定，結(jié)果表明金櫻根薔薇酸含量在0.25%～0.63%，說明不同產(chǎn)地的薔薇酸含量存在差異。

30批金櫻根直徑范圍1.1～5.9 cm，變異系數(shù)達到47.2%，說明不同產(chǎn)地金櫻根直徑大小存在較在差異，可通過感官鑒別可直接分辨大小。醇溶性浸出物的含量在12%～28%，均符合《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）對金櫻根浸出物規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（不少于10%）。

2.4? 金櫻根藥材等級建立的研究

2.4.1? 聚類指標(biāo)的擬定與分級? 考慮到傳統(tǒng)藥材采用“辨狀論質(zhì)”的原則，再結(jié)合藥材關(guān)鍵質(zhì)量屬性，故選擇直徑、醇溶性浸出物、薔薇酸含量作為金櫻根藥材分級指標(biāo)。

2.4.2? 分級? 將每份金櫻根樣品的直徑、浸出物、含量作為聚類指標(biāo)，運用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對30批金櫻根樣品進行分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，可將30批金櫻根樣品分為3類：樣品S16聚為一類，為一等品;樣品S1、S3、S6、S12、S17、S21、S25、S26、S29聚為一類，為二等品;其他20份樣品聚為一類，為統(tǒng)貨樣品。匯總分析見表8。

同時結(jié)合各樣品產(chǎn)地及含量結(jié)果情況分析，一等品1批，分布產(chǎn)地為湖南吉首（1批）;二等品共9批，分布產(chǎn)地為湖南吉首（6批）、湖南張家界（1批）、廣西桂林（1批）、貴州銅仁（1批）;二等品等級以上產(chǎn)地主要分布在湖南省、廣西省、貴州省。

3 討論

金櫻根為常見藥材，但在各省收載的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)簡單，多以性狀鑒別為主，僅少量含有薄層鑒別[6，10]，不僅方法的前處理過程較為復(fù)雜、耗時，而且不環(huán)保，本研究從提取溶劑、提取方式、展開劑方面對薄層鑒別方法作了優(yōu)化篩選，且增加活性成分薔薇酸作為對照，對影響薄層鑒別的主要因素如不同薄層板的比較、展開溫度、濕度等進行考察，發(fā)現(xiàn)薄層板的種類、溫濕度對分離效果影響均較小，優(yōu)化后的方法展開斑點數(shù)目較多且清晰，分離效果好，Rf值重復(fù)性好，可以區(qū)分偽品，對金櫻根藥材具有較好的鑒別效果。

金櫻根主要含三萜、黃酮、鞣質(zhì)類成分，其中質(zhì)控成分薔薇酸與委陵菜酸同為三萜類同分異構(gòu)體，較難分開，故文獻采用五氟苯基混合鍵合在超高純堿基去活硅膠基的PFP-C18柱[15]，兼顧C18與五氟苯基的雙重特點，具有獨特的選擇性，相對于其他普通C18柱有明顯的優(yōu)勢，但專用色譜柱柱壓高，檢驗成本高，實驗中嘗試不同廠家不同規(guī)格PFP色譜柱，包含SHIMADZU Shim-pack Scepter PFPP-120 （150 mm×4.6 mm，3 μm）、菲羅門 Titank F5（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Waters Xselect HSS PFP（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CAPCELL PAK PFP （250 mm×4.6 mm，5 μm），經(jīng)過多批次多基原樣品測定，最終確定Waters Xselect HSS PFP（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色譜柱檢測結(jié)果與文獻[15]報道色譜柱結(jié)果一致，拓展了色譜柱的耐用性，所測定結(jié)果均一致，并根據(jù)實測結(jié)果建立金櫻根藥材的特征圖譜，在一定程度上豐富了金櫻根藥材的鑒別方法，為其質(zhì)量控制提供參考，提高了金櫻根的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。將不同產(chǎn)地金櫻根按照提升后的質(zhì)控方法進行檢驗，采用聚類分析法對30批金櫻根藥材進行等級評價，對中藥材的等級標(biāo)準(zhǔn)進行有益嘗試，結(jié)果顯示，不同省份的不同批次樣品質(zhì)量波動較大，而湖南省樣品優(yōu)質(zhì)且不同批次質(zhì)量較穩(wěn)定。

本研究從藥材的特征性成分出發(fā)，分別從定性和定量兩個方面對金櫻根藥材進行質(zhì)量評價，結(jié)合傳統(tǒng)的中藥材分級方法和現(xiàn)代科學(xué)方法，制定一套金櫻根藥材完整的評價方法，達到提升該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的目的。本方法結(jié)果準(zhǔn)確、簡便、客觀，重復(fù)性好，可用于藥材的質(zhì)量控制;不同產(chǎn)地重金屬含量均在中國《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定范圍內(nèi)，處于安全水平。本研究所提出的3個等級規(guī)格藥材的不同等級特性區(qū)分明顯，實踐中容易掌握，對藥材的采收加工、銷售流通及臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)和實踐意義。

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