馮娟 唐磊彬

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺組織中最多的惡性腫瘤，女性較多見，男女比例為1∶5～1∶2[1]。任何年齡均可發(fā)病，女性在45～54歲發(fā)病率最高，男性在60～64歲發(fā)病率最高[2]。甲狀腺乳頭狀癌生物學行為相對惰性，生長緩慢，惡性程度較低，然而年齡對預后影響較大，年輕人預后很好，很少因腫瘤而死亡。但隨著年齡的增長，甲狀腺乳頭狀癌的惡性程度也相應增高[3]。甲狀腺乳頭狀癌患者10年生存率超過95%[4]。因此，甲狀腺乳頭狀癌早期的明確診斷具有重要意義。世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）將腫瘤直徑＜1 cm的甲狀腺乳頭狀癌定義為甲狀腺乳頭狀微小癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）。最近幾十年來甲狀腺乳頭狀微小癌的發(fā)病率不斷上升，已經嚴重威脅著人們的身心健康[5]。在臨床工作中，甲狀腺乳頭狀微小癌與腫塊大小相近的甲狀腺良性病變伴乳頭狀增生的病例在細胞形態(tài)及組織結構等方面具有相似性且難以鑒別，從而導致出現誤診及漏診的情況，使患者失去最佳的治療時機，進而影響患者預后。因此臨床上需要尋求一種安全有效的診斷方法，來提高疾病診斷準確率及指導臨床治療。最近幾十年，隨著免疫分子學研究的深入，發(fā)現一些特異性的標志物可以用來協助甲狀腺乳頭狀微小癌的診斷。本研究探討和分析細胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）、人骨髓內皮細胞標記物（mesothelioma， HBME-1）和半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）聯合檢測在甲狀腺乳頭狀微小癌中的表達及其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年10月—2022年9月湖南省職業(yè)病防治院收治的甲狀腺乳頭狀微小癌患者48例為觀察組，甲狀腺良性乳頭狀病變48例為對照組。甲狀腺乳頭狀微小癌組48例，其中男性12例，女性36例，年齡24～65歲，平均年齡（47.48±10.93）歲。甲狀腺良性乳頭狀病變組48例，其中男性15例，女性33例，年齡33～68歲，平均年齡（50.83±9.54）歲。兩組性別及年齡等一般臨床資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經湖南省職業(yè)病防治院醫(yī)學倫理委員會審查批準，并且取得患者知情同意，符合醫(yī)學倫理標準。

1.2 方法

免疫組織化學染色方法采用德國Leica（型號 LEICA BOND-MAX）全自動免疫組化染色機進行染色。染色方法為鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidinperosidase，SP）二步法。石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，流水沖洗；抗原修復；切片上滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，3 min/次；切片上滴加一抗，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加生物素標記的第二抗體聚合物，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min /次；除去PBS，切片上滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑顯色10 min；蘇木素復染返藍；脫水；透明；封片。CK19、HBME-1和Gal-3抗體試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，免疫組化顯色試劑購自Leica生物系統公司。

1.3 判定標準

CK19陽性信號主要定位于細胞質、HBME-1陽性信號主要定位于細胞質、Gal-3陽性信號定位于細胞質及部分細胞核。陽性信號染色強度的評分標準：0分為無著色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色。陽性細胞百分比：0分為無任何陽性細胞著色、1分為0＜陽性細胞百分數≤25%、2分為25%＜陽性細胞百分數≤50%、3分為50%＜陽性細胞百分數≤75%、4分為陽性細胞百分數＞75%。兩項計分相加，得分為0、1、2、3、4、5、6、7分。陰性（-）計為0分、弱陽性（+）計為2～3分、中度陽性（++）計為4～5分、強陽性（+++）計為6～7分。

1.4 觀察指標

CK19在觀察組陰性（-）2例、弱陽性（+）3例、中度陽性（++）18例、強陽性（+++）25例；在對照組陰性（-）22例、弱陽性（+）25例、中度陽性（++）1例、強陽性（+++）0例。HBME-1在觀察組陰性（-）3例、弱陽性（+）2例、中度陽性（++）23例、強陽性（+++）20例；在對照組陰性（-）38例、弱陽性（+）10例、中度陽性（++）0例、強陽性（+++）0例。Gal-3在觀察組陰性（-）2例、弱陽性（+）2例、中度陽性（++）18例、強陽性（+++）26例；在對照組陰性（-）33例、弱陽性（+）15例、中度陽性（++）0例、強陽性（+++）0例。靈敏度=真陽性例數/（真陽性+假陰性）例數；特異度=真陰性例數/（真陰性+假陽性）例數；陽性預測值=真陽性例數/（真陽性+假陽性）例數；陰性預測值=真陰性例數/（真陰性+假陰性）例數；正確率=（真陽性+真陰性）例數/（真陽性+假陽性+真陰性+假陰性）例數。

1.5 統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗；CK19、HBME-1和Gal-3各指標單項診斷與聯合診斷作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷標志物有效性的評估；應用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析CK19、HBME-1和Gal-3對甲狀腺乳頭狀微小癌診斷效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CK19、HBME-1和Gal-3的表達模式

CK19、HBME-1和Gal-3蛋白在甲狀腺乳頭狀微小癌組織中均呈現陽性表達，且CK19蛋白的陽性信號主要定位于細胞質（圖1A）；HBME-1蛋白的陽性信號主要定位于細胞質（圖1B）；Gal-3蛋白陽性信號主要定位于細胞質及部分細胞核（圖1C）。

圖1 免疫組織化學檢測甲狀腺乳頭狀微小癌CK19、HBME-1和Gal-3的表達及組織形態(tài)學特征HE染色

2.2 兩組病理標本中CK19、HBME-1和Gal-3表達情況比較

觀察組病理標本中CK19、HBME-1和Gal-3陽性率分別為95.83%（46/48）、93.75%（45/48）、95.83%（46/48），均高于對照組的54.17%（26/48）、20.83%（10/48）、31.25%（15/48），差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 CK19、HBME-1和Gal-3在觀察組與對照組中的表達狀況

2.3 CK19、HBME-1和Gal-3各指標單項診斷與聯合診斷作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷標志物有效性的評估

按照靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及正確率對CK19、HBME-1和Gal-3各指標單項診斷與聯合診斷作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷標志物有效性的評估。串聯聯合檢測定義為CK19、HBME-1、Gal-3同時表達陽性可診斷甲狀腺乳頭狀微小癌；并聯聯合檢測定義為CK19、HBME-1、Gal-3任意1項陽性即可診斷甲狀腺乳頭狀微小癌。單項檢測中CK19和Gal-3靈敏度最高，HBME-1特異度最高，而3項并聯聯合檢測的靈敏度最高，串聯聯合檢測的特異度、陽性預測值以及正確率均比各單項檢測高。見表2。

表2 各指標單項診斷與聯合診斷作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷標志物有效性的評估（%）

2.4 CK19、HBME-1和Gal-3對甲狀腺乳頭狀微小癌的診斷價值分析

ROC曲線分析表明，CK19、HBME-1和Gal-3各單項指標與串聯及并聯聯合檢測在甲狀腺乳頭狀微小癌患者中的靈敏度均較高，但串聯聯合檢測特異度及曲線下面積最高。見圖2。

圖2 CK19、HBME-1和Gal-3在甲狀腺乳頭狀微小癌中的診斷ROC曲線

3 討論

甲狀腺乳頭狀微小癌起病隱匿，通常無特異性臨床癥狀與體征，起初只表現為超聲檢查下的1 cm以內的無痛性小結節(jié)。甲狀腺乳頭狀微小癌的診斷主要依據含纖維血管軸心的復雜分枝狀乳頭及典型明確的核特征性改變，如核擁擠、核重疊、核溝、毛玻璃樣核、核內假包涵體等（圖1D）。然而，有些甲狀腺乳頭狀微小癌的病例，典型核特征不明顯。同時，有一些甲狀腺良性病變也可出現核的輕微形態(tài)學變化及乳頭狀增生。使得甲狀腺乳頭狀微小癌與甲狀腺良性乳頭狀增生的病變在鑒別診斷上存在較大的困難。從而，造成部分甲狀腺乳頭狀微小癌出現漏診、誤診等情況，延誤患者病情，不利于患者預后。在臨床工作中，及時對甲狀腺乳頭狀微小癌作出明確的診斷，提高其診斷準確率是病理醫(yī)師急需要解決的重要問題之一。因此，運用有效的甲狀腺乳頭狀癌分子標志物進行檢測其表達狀況來輔助診斷是有必要的。

CK19是分子量最低的一種細胞角蛋白，主要作用是參與細胞信號傳導，維持細胞的完整性及調控細胞凋亡，在多種上皮組織和腫瘤中表達[6-7]。研究結果表明，在甲狀腺乳頭狀癌組織中CK19一般呈現彌漫性的強陽性表達，是診斷甲狀腺乳頭狀癌較好的腫瘤分子標志物。相反，在甲狀腺組織乳頭狀增生的區(qū)域通常缺乏CK19的表達或者呈現弱陽性表達[8-9]。HBME-1為人骨髓內皮細胞標記物，也是間皮細胞表面微絨毛的一種特征性抗原成分，在腫瘤的血管形成、腫瘤細胞增殖及腫瘤轉移等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[10]。近年來，研究發(fā)現在甲狀腺乳頭狀癌組織中HBME-1陽性表達率通常較高，在良性增生性病變中僅少數表達或不表達[11]。表明HBME-1是甲狀腺乳頭狀癌的又一良好腫瘤分子標記物，對甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺腺瘤及結節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生病變有良好的鑒別診斷作用。半乳糖凝集素3（galectin-3）具有可溶性，為β-半乳糖苷結合蛋白中的成員，分子量31 kDa，主要由巨噬細胞分泌的一種細胞外和細胞內凝集素，在正常和病理生理條件下可與細胞外基質蛋白物、細胞表面特殊分子及胞內糖蛋白相互作用。Gal-3具有十分主要的生物學功能，在細胞增殖、黏附、凋亡、侵襲、機體炎癥反應及腫瘤轉移等多種生理、病理過程中起著十分重要的作用[12]。最近的研究表明，Gal-3與腫瘤的侵襲轉移的幾個步驟有關，如與腫瘤細胞外基質相互作用、血管生成、通過血流傳播和外滲[13]。目前國內外多項研究表明，Gal-3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達陽性率顯著高于甲狀腺良性增生性病變[14]。

本研究結果顯示，甲狀腺乳頭狀微小癌組織CK19、HBME-1、Gal-3蛋白陽性表達率顯著高于甲狀腺良性乳頭狀病變組織，且差異有統計學意義（P＜0.01）。與上述各學者研究結果一致，表明以上3項分子標志物在甲狀腺乳頭狀微小癌臨床診斷中具有重要意義[15]。在CK19、HBME-1和Gal-3各指標單項診斷與聯合診斷作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷標志物有效性的評估中發(fā)現：單獨使用高表達CK19、HBME-1和Gal-3蛋白作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷標志物時，靈敏度相對較高時，特異性就會相對較低，無法判讀哪個標志物更好。由此，將靈敏度與特異度綜合起來評價分子標志物的有效性。正確率表示觀察結果與實際結果的符合程度，是靈敏度與特異度的加權平均。CK19、HBME-1和Gal-3串聯聯合檢測時，正確率最高。由此可推斷，CK19、HBME-1和Gal-3串聯聯合檢測可作為甲狀腺乳頭狀微小癌診斷有效分子標志物[16]。本研究ROC曲線分析顯示串聯聯合檢測曲線下面積均最大，其診斷價值最大，與上述正確率結果可相互佐證。文章的研究結果為甲狀腺乳頭狀微小癌的后期標準制定提供了借鑒內容。

本次研究通過免疫組化的方法在甲狀腺乳頭狀微小癌標本中檢測了CK19、HBME-1和Gal-3蛋白的定位，并進行了初步半定量分析。然而CK19、HBME-1和Gal-3蛋白具體通過什么機制與信號通路對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產生影響還未得知。下一步實驗研究方案可從細胞培養(yǎng)、動物模型及基因檢測等方面研究CK19、HBME-1和Gal-3在甲狀腺乳頭狀微小癌中的信使RNA（messenger RNA， mRNA）和蛋白表達水平繼續(xù)深入研究。

綜上所述，CK19、HBME-1和Gal-3在甲狀腺乳頭狀微小癌中呈高表達，可作為甲狀腺乳頭狀微小癌的有效診斷指標。各單項單獨用于診斷甲狀腺乳頭狀微小癌易受多種因素影響，具有一定的局限性，而采用串聯聯合檢測可彌補單一診斷的不足與缺陷，使診斷價值顯著提高，作為甲狀腺乳頭狀微小癌病理診斷的有效輔助方法進而提高其準確率。