黎海燕，陳 馨，田素英，3，4

(1.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣東省化妝品工程技術(shù)中心，廣東 中山 528458；4.廣東藥科大學(xué) 大健康協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 中山 528458)

金櫻根為薔薇科植物金櫻子(RosalaevigataMichx.)的干燥根[1]，最早始見于《日華子本草》：“金櫻子根，平，無毒。治寸白蟲，銼二兩，入糯米三十粒。水二升，煎五合，空心服，須臾瀉下；金櫻子根皮，炒，止瀉血及崩中帶下?！盵2]其根和根皮可固精澀腸，主治滑精、遺尿、痢疾泄瀉、月經(jīng)失調(diào)、崩漏帶下、子宮脫垂、痔瘡、燙傷、早泄性不育癥等多種病癥[3]。

沒食子兒茶素和兒茶素是金櫻根主要的活性成分[4]，兒茶素類化合物有明顯的清除體內(nèi)自由基、抗病毒、抗癌、抗心律失常、調(diào)節(jié)血脂血糖等活性[5]，Michalina等[6]研究表明，兒茶素在體外細(xì)胞培養(yǎng)中可抑制α-葡萄糖苷酶和組織糖原磷酸化酶，抑制胰高血糖素刺激的葡萄糖產(chǎn)生，從而改善Ⅱ型糖尿病。

黃慧等[7]研究結(jié)果表明，不同炮制方法對(duì)金櫻根中總鞣質(zhì)含量和總黃酮含量[8]都影響較大。而兒茶素類屬黃酮類化合物，也是鞣質(zhì)的前體。因此，本實(shí)驗(yàn)通過RP-HPLC法[9]對(duì)金櫻根炮制前后的主要活性成分沒食子兒茶素與兒茶素進(jìn)行含量變化測(cè)定，為中藥臨方炮制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

數(shù)控超聲波清洗器(KH-3000E，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，uitimate 3000)；液相色譜柱(Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司)；十萬分之一電子天平(德國賽多利斯電子天平)。

1.2 材料

1.2.1 試劑 沒食子兒茶素對(duì)照品、兒茶素對(duì)照品(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：201110、201209)；色譜甲醇 (天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20200308)；磷酸(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20200608)；甲醇(AR，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司，批號(hào)：20080729)。

1.2.2 金櫻根及其炮制品 金櫻根生品(廣西省河池市，經(jīng)田素英副教授鑒定符合2020版中國藥典(一部)附錄標(biāo)準(zhǔn))。

醋炙：將凈制后的金櫻根10 g，加入定量的醋攪拌均勻，悶潤，待醋被吸盡后，置炒制容器中，先預(yù)熱鍋底，用文火炒至一定程度(微黃)，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用米醋20 kg。

鹽炙：將食鹽0.2 g加適量清水溶解，與凈制后的金櫻根10 g攪拌均勻，放置悶潤，等待鹽水被吸盡后，置炒制容器中，先預(yù)熱鍋底，用文火炒至一定程度(微黃)，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用食鹽2 kg。

黑豆汁制：取黑豆1 kg加適量水，煮約4 h，熬汁得黑色渾濁液體1.5 kg；黑豆渣再加水煮3 h，熬汁1.0 kg，合并得黑豆汁約2.5 kg。取凈制后的金櫻根10 g與黑豆汁按比例量攪拌均勻，隔水蒸1 h，使黑豆汁深入藥物內(nèi)部。60 ℃烘干藥材，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用黑豆10 kg。

蜜炙：將凈制后的金櫻根10 g，加入定量的煉蜜攪拌均勻，悶潤，待煉蜜被吸盡后，置炒制容器中，先預(yù)熱鍋底，用文火炒至一定程度(微黃)，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用煉蜜30 kg。

炒炭：將凈制后的金櫻根10 g置熱鍋內(nèi)，用武火炒至藥材表面呈焦黑色，內(nèi)部呈焦黃色時(shí)，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸(17∶83∶0.1，v/v)，進(jìn)樣量10 μL，流速，1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長210 nm，柱溫：室溫。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取兒茶素對(duì)照品10.00 mg，以甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中搖勻，制成1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取沒食子兒茶素對(duì)照品2.50 mg，以甲醇定容于5 mL棕色容量瓶中搖勻，制成0.50 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取兒茶素和沒食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液600 μL用甲醇稀釋定容于5 mL棕色容量瓶中制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取藥材剪成段，粉碎，過5號(hào)篩，制成細(xì)粉密封保存。精密稱取藥材粉末置于30 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取40 min，放至室溫，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，理論塔板計(jì)算不低于4 000(沒食子兒茶素4 286，兒茶素4 315，樣品4 127)。2個(gè)色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5(見圖1)。

2.4 方法學(xué)線性關(guān)系考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋定容于10 mL容量瓶中，制成一系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；精密吸取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL沒食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋定容于10 mL容量瓶中，制成一系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量液。充分搖勻后，過0.45 μm微孔濾膜，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得兒茶素和沒食子兒茶素的回歸方程。兒茶素的線性回歸方程為：y=3×107x+191 442，r=0.999 5，在0.200～1.000 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系好。沒食子兒茶素的線性回歸方程為：y=4×107x-4 647，r=0.999 6，在0.10～0.50 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

注：(a)對(duì)照品；(b)供試品；(a)2.沒食子兒茶素；3.兒茶素；(b)3.沒食子兒茶素；10.兒茶素。圖1 兒茶素和沒食子兒茶素圖譜

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取藥材6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，過0.45 μm微孔濾膜，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算沒食子兒茶素和兒茶素的色譜峰峰面積RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：沒食子兒茶素和兒茶素峰面積RSD值分別為0.96%(n=6)和1.66%(n=6)。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算沒食子兒茶素和兒茶素的色譜峰峰面積的RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：沒食子兒茶素和兒茶素峰面積的RSD值分別為1.02%(n=6)和0.88%(n=6)。結(jié)果表明，儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液。取同一供試品溶液，分別于室溫下在0、2、4、6、8、10 h內(nèi)，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算沒食子兒茶素和兒茶素的色譜峰峰面積的RSD值。沒食子兒茶素和兒茶素峰面積RSD值分別為1.47%和0.87%，結(jié)果表明，樣品溶液室溫放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密量取已知含量的同一批號(hào)樣品，共5份。分別精密加入沒食子兒茶素和兒茶素對(duì)照品儲(chǔ)備液300 μL和1 600 μL，充分混勻后按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣方法依次進(jìn)樣，測(cè)定沒食子兒茶素和兒茶素峰面積，并計(jì)算沒食子兒茶素和兒茶素含量，測(cè)定值應(yīng)在線性范圍內(nèi)，用實(shí)測(cè)值與原樣品含被測(cè)成分量之差，除以加入純品量，計(jì)算回收率。沒食子兒茶素平均回收率100.63%，RSD值為3.96%(n=5)；兒茶素平均回收率102.43%，RSD值為1.34%(n=5)，表明沒食子兒茶素和兒茶素良好。見表1。

表1 沒食子兒茶素和兒茶素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

取6份金櫻根不同炮制品剪成段，粉碎，過5號(hào)篩，制成細(xì)粉密封保存。精密稱取金櫻根粉末生品1.002 g、鹽制品1.002 g、蜜制品1.002 g、炒炭品1.002 g、醋制品1.001 g，以及黑豆汁制品1.002 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣方法測(cè)定，每個(gè)炮制樣品平行測(cè)定3組，并計(jì)算其RSD值。見表2。

表2 不同炮制品沒食子兒茶素和兒茶素的含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

由表2可知，沒食子兒茶素含量為：蜜炙品>鹽炙品>黑豆汁制品>醋炙品>生品>炒炭；兒茶素含量為：鹽炙品>醋炙品>黑豆汁制品>蜜炙品>生品>炒炭。根據(jù)上述結(jié)果可知，鹽炙、醋炙品、黑豆汁制品、蜜炙品四種炮制方法可顯著提高金櫻根中兒茶素和沒食子兒茶素的含量，而炒炭炮制方法則降低金櫻根中兒茶素和沒食子兒茶素的含量，因此炒炭在提高兒茶素類有效成分方面上不能很好地發(fā)揮作用。

3 討論

3.1 選擇金櫻根炮制方法思路

中藥材通過炮制可達(dá)到增加療效，減低毒性的作用。其中，醋味酸、苦，性溫，具有引藥入肝、散瘀止血、理氣止痛的功效。食鹽，味咸性寒，有清熱涼血的作用，而鹽炙藥物則有引藥下行，增強(qiáng)補(bǔ)腎固精、利尿、清熱、滋陰降火涼血等作用。煉蜜具有補(bǔ)益脾胃、潤肺止咳、緩中止痛的作用。黑豆性味甘、平，能祛風(fēng)、滋補(bǔ)肝腎、解毒、活血，藥物經(jīng)黑豆汁制后可增強(qiáng)藥物療效，降低藥物毒性或副作用。炒炭既有增強(qiáng)止血的作用，又有緩和藥性、降低毒性的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合金櫻根的功效主治設(shè)計(jì)用醋炙、鹽炙、蜜炙、黑豆汁制、炒炭法進(jìn)行有效成分變化對(duì)比研究。

3.2 色譜條件優(yōu)化

采用文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定沒食子兒茶素和兒茶素含量的流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(28∶72∶0.1，v/v)。但沒食子兒茶素和兒茶素的分離度不佳，峰形對(duì)稱性亦不佳。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合參考文獻(xiàn)，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行多次調(diào)整，最后本實(shí)驗(yàn)用甲醇-水-磷酸(17∶83∶0.1，v/v)洗脫時(shí)，沒食子兒茶素和兒茶素分離度好，雜質(zhì)干擾少，故采用甲醇-水-磷酸(17∶83∶0.1，v/v)作為流動(dòng)相。色譜柱有正相色譜柱和反相色譜柱之分，因沒食子兒茶素和兒茶素均為黃酮類化合物，而黃酮類化合物大多具有多個(gè)羥基，因此采用反相色譜柱較為合適[9]。本研究確定的色譜條件分離效果好，方法穩(wěn)定，且在該色譜條件下均可得到很好的分離測(cè)定，沒食子兒茶素和兒茶素的分離度均大于2。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)知，相關(guān)研究中采用200 nm及280 nm[11-12]作為測(cè)定兒茶素類的最大波長居多，系列預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)最大波長為210 nm時(shí)，峰形、峰高良好，因而確定210 nm為檢測(cè)波長。

3.3 提取方法選擇

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者嘗試了超聲提取、冷浸提取、回流提取方法[11]，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)，回流提取方法中沒食子兒茶素的含量較少，這是由于沒食子兒茶素在高溫條件下易分解成其他物質(zhì)，而冷浸提取和超聲提取中沒食子兒茶素和兒茶素的含量相近，冷浸提取需要24 h，超聲提取只需40 min，經(jīng)綜合考慮，超聲提取更符合實(shí)際情況，因而選用超聲提取法。

3.4 結(jié)果和意義

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同炮制方法對(duì)金櫻根中有效成分含量影響較大，蜜炙品(0.849 5 mg/g)>鹽炙品(0.831 7 mg/g)>黑豆汁制品(0.733 0 mg/g)>醋炙品(0.685 3 mg/g)>生品(0.652 0 mg/g)>炒炭(0.503 2 mg/g)；兒茶素含量為：鹽炙品(10.697 mg/g)>醋炙品(10.449 mg/g)>黑豆汁制品(9.486 mg/g)>蜜炙品(8.394 mg/g)>生品(6.116 mg/g)>炒炭(4.235 mg/g)。其中，鹽炙、醋炙品、黑豆汁制品、蜜炙品4種炮制方法可顯著提高金櫻根中沒食子兒茶素和兒茶素的含量，結(jié)合金櫻根功效“祛瘀止痛、固精澀腸”，建議臨床應(yīng)用金櫻根時(shí)應(yīng)結(jié)合臨床主證進(jìn)行不同的炮制，以提高其臨床療效。

金櫻根臨床應(yīng)用廣泛，如湖南株洲千金藥業(yè)婦科千金片、廣東中智藥業(yè)金雞膠囊、廣東省羅浮山白鶴制藥廠等多家生產(chǎn)的廣東涼茶、桂林三金藥業(yè)三金片等，但均未見其對(duì)金櫻根進(jìn)行炮制研究，故針對(duì)金櫻根的炮制研究較少，本研究團(tuán)隊(duì)的前期成果僅對(duì)金櫻根炮制前后總鞣質(zhì)、總黃酮的含量改變進(jìn)行了探討，而未對(duì)單一成分進(jìn)行研究，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)金櫻根臨床炮制應(yīng)用具有參考價(jià)值。