寇卜心，柴夢音，豆雙雙，劉曉霓*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069；2.北京市肝病研究所，北京 100069)

超微粉碎技術(shù)是一種新型物料加工物理技術(shù)[1]。中藥利用該技術(shù)可以提高中藥的細(xì)胞破壁率，從而提高有效成分的溶出率[2]，提高了藥物的釋放量和釋放速度，有利于藥物的吸收[3]，使得小劑量的超微粉碎破壁中藥即可達(dá)到大劑量中藥材的藥效成為可能，極大地節(jié)約中藥資源。

黃芪是一味藥用歷史悠久、臨床應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，具有免疫調(diào)節(jié)作用[4-5]。本文建立環(huán)磷酰胺小鼠免疫失衡模型，觀察了黃芪超微粉對(duì)該模型小鼠免疫功能的影響，并與黃芪飲片進(jìn)行了比較，為黃芪超微粉的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5～6周齡SPF級(jí)ICR小鼠60只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0011，所有小鼠飼養(yǎng)SPF屏障環(huán)境內(nèi)，12 h/12 h的光照/黑暗條件，溫度20～26 ℃，自由采食和飲水。

1.1.2 藥材及儀器 黃芪飲片購自北京同仁堂藥店；環(huán)磷酰胺購自山西普德藥業(yè)股份有限公司；CD3、CD19、CD314抗體購自BD公司；PHA購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；MTT購自Sigma公司；IL-2和INF-γ Elisa試劑盒購自RayBiotech公司。流式細(xì)胞儀(貝克曼Cytoflex)，MultiskanGO酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 5～6周齡昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)、模型組(M)、黃芪飲片組(HQY，10 g/kg)、黃芪超微粉高劑量組(HQFH，10 g/kg)、黃芪微細(xì)粉中劑量組(HQFM，2 g/kg)、黃芪微細(xì)粉低劑量組(HQFL，0.4 g/kg)，每組10只，雌雄各半。模型組和各藥物組腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg)，連續(xù)4天，然后每周強(qiáng)化1次，共強(qiáng)化2次，與末次強(qiáng)化后第1天，取材進(jìn)行指標(biāo)檢測。各藥物組從模型制備第1天開始給藥直至取材前一天，對(duì)照組和模型組給與相同體積生理鹽水。

1.2.2 胸腺指數(shù)和脾指數(shù) 稱取小鼠體重、胸腺重量、脾臟重量，計(jì)算脾指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重量/體重；脾指數(shù)=脾臟重量/體重

1.2.3 脾臟淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化和細(xì)胞因子分泌測定 無菌取出脾臟，置于盛有適量RPMI 1640培養(yǎng)基平皿中磨碎，用無菌培養(yǎng)基洗1次，加入適量紅細(xì)胞裂解5 min，無菌培養(yǎng)基洗1次，用70 μm細(xì)胞篩濾過得到游離單個(gè)脾細(xì)胞，臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液分兩孔加入96孔板，每孔200 μL，其中一孔加入5 μL PHA(終濃度1 μg/mL)，另一孔作為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h取出，每孔吸出上清100 μL待用，加入10 μL MTT(5 mg/mL)，作用4 h后加入DMSO 150 μL，震蕩混勻，用酶標(biāo)儀570 nm處測OD值。刺激指數(shù)=(加PHA細(xì)胞OD值-不加PHA細(xì)胞OD值)/不加PHA細(xì)胞OD值。脾細(xì)胞上清IL-2和INF-γ細(xì)胞因子采用ELISA法測定，按照試劑盒說明操作。

1.2.4 外周血和脾臟免疫細(xì)胞分群檢測 末次給藥后眼眶取血，提取血漿后，將血細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液裂紅，2% FBS-PBS液體洗1次，用2% FBS-PBS液體重懸細(xì)胞，取出100 μL到流式管中，加入抗體，混勻避光孵育20 min，加入lysing buffer，混勻避光孵育15 min，300 g離心5 min后，棄上清，再加入2 mL 2% FBS0-PBS液體洗2次，上流式細(xì)胞儀檢測。脾臟置入2 mL的2% FBS-PBS培養(yǎng)皿中研磨，200目細(xì)胞篩過濾，將血細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液裂紅，2% FBS-PBS液體洗1次，300 g 5 min離心后棄上清，與血中免疫細(xì)胞處理方式相同。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示統(tǒng)計(jì)量，計(jì)量資料采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪超微粉對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，80 mg/kg環(huán)磷酰胺可以使小鼠胸腺指數(shù)明顯降低，黃芪飲片以及各黃芪超微粉組可以明顯升高胸腺指數(shù)。與對(duì)照組比較，80 mg/kg環(huán)磷酰胺可以造成小鼠脾臟腫大，脾指數(shù)明顯升高，黃芪飲片以及各黃芪超微粉組可以明顯降低脾指數(shù)。見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖1 黃芪超微粉對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

2.2 黃芪超微粉對(duì)小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化和分泌細(xì)胞因子能力的影響

與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺模型組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)明顯降低；與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組以及黃芪超微粉各組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著增加。與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺模型組脾細(xì)胞上清中的IL2和INFγ的含量顯著降低；與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組以及黃芪超微粉各組的脾細(xì)胞上清中的IL2和INFγ的含量顯著增加。見圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖2 黃芪超微粉對(duì)小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和脾上清細(xì)胞因子的影響

2.3 黃芪超微粉對(duì)免疫細(xì)胞亞群的影響

2.3.1 黃芪超微粉對(duì)外周血免疫細(xì)胞亞群的影響 與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組CD3+細(xì)胞比例明顯增高，與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉中劑量、高劑量組的CD3+細(xì)胞比例明顯降低；與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組CD19+、CD314+細(xì)胞比例明顯降低，與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉低劑量、中劑量、高劑量組的CD19+、CD314+細(xì)胞比例明顯升高。見圖3。

2.3.2 黃芪超微粉對(duì)脾臟免疫細(xì)胞亞群的影響 與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組CD3+細(xì)胞比例明顯增高，與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉低劑量、中劑量、高劑量組的CD3+細(xì)胞比例明顯降低；與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組CD19+細(xì)胞比例明顯降低，與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉中劑量、高劑量組的CD19+細(xì)胞比例明顯升高；與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組CD314+細(xì)胞比例明顯降低，與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉低劑量、中劑量、高劑量組的CD314+細(xì)胞比例明顯升高。見圖4。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖3 黃芪超微粉對(duì)外周血免疫細(xì)胞亞群的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖4 黃芪超微粉對(duì)脾臟免疫細(xì)胞亞群的影響

3 討論

傳統(tǒng)中藥飲片細(xì)胞破壁率極低(小于3%)，細(xì)胞內(nèi)的中藥有效成分釋放率低，不能充分發(fā)揮藥效。超微粉碎技術(shù)使中藥細(xì)胞壁在粉碎過程中大量被破壞，有效成分不需要通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜即能釋放出來，提高了藥物的釋放量和釋放速度，極大地提高中藥藥效[6]。本研究通過觀察黃芪超微粉對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫失衡小鼠的免疫功能的影響，為黃芪超微粉的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

胸腺和脾臟分別是機(jī)體的中樞和外周免疫器官，前者是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化和成熟的場所，后者是成熟免疫細(xì)胞定居的場所，也是免疫細(xì)胞在抗原刺激下發(fā)生免疫應(yīng)答的部位[7]。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺可以致小鼠胸腺指數(shù)降低，脾指數(shù)升高，脾細(xì)胞刺激指數(shù)降低，與相應(yīng)學(xué)者的報(bào)道結(jié)果基本一致[7-9]。模型組脾指數(shù)升高是由于環(huán)磷酰胺致小鼠脾臟代償性增大所引起的，原因可能是環(huán)磷酰胺抑制骨髓，導(dǎo)致貧血，脾臟代償性造血所致。IL2和INFγ是具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的淋巴因子。IL-2主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，可以激活T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)和記憶反應(yīng)[10]。INF-γ主要由輔助T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，是可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞極化的細(xì)胞因子[11]。CD3、CD19是T細(xì)胞、B細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD314在NK細(xì)胞中表達(dá)，激活殺傷細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性活動(dòng)，參與NK細(xì)胞介導(dǎo)的骨髓移植排斥反應(yīng)，可能對(duì)NK細(xì)胞的分化和存活起調(diào)節(jié)作用[12]。本研究結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺組小鼠脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子IL2和INFγ含量減少，外周血和脾臟中的CD3+細(xì)胞比例明顯升高，CD19+和CD314+細(xì)胞比例明顯降低。這些結(jié)果提示環(huán)磷酰胺可以導(dǎo)致小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫以及先天免疫功能失調(diào)。

本研究中，黃芪飲片以及黃芪超微粉可以提高環(huán)磷酰胺所致胸腺指數(shù)降低。程昊[13]、陳潔君等[14]也發(fā)現(xiàn)黃芪超微粉和破壁粉可以提高動(dòng)物的胸腺指數(shù)，與我們的研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)黃芪飲片以及黃芪超微粉可以逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺引起的脾腫大，降低脾指數(shù)，增高脾細(xì)胞刺激指數(shù)和脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子IL2和INFγ含量。黃芪飲片和黃芪超微粉各組可以降低環(huán)磷酰胺模型組小鼠外周血和脾臟中的CD3+細(xì)胞比例，明顯升高CD19+和CD314+細(xì)胞比例，提示黃芪飲片以及各劑量黃芪超微粉能夠有效對(duì)抗環(huán)磷酰胺所致的免疫失衡。值得注意的是：小劑量黃芪超微粉組即可以達(dá)到黃芪飲片的藥效，但是黃芪超微粉高、中、低劑量組差異不顯著，是否與黃芪超微粉的生物利用度有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。