邵佳，趙遠來，馮琰玉，潘洋，于金珠，秦華，陳俊輝*

（1.安徽省交通航務工程有限公司，合肥 230011；2.浙江農林大學環(huán)境與資源學院，杭州 311300）

鉛（Pb）、鎘（Cd）是兩種毒性高、隱蔽性強的重金屬元素，可在生物體內富集，進而通過食物鏈等途徑危害人體健康。鉛鎘污染可改變植物細胞膜透性和細胞結構，損害植物生長，造成作物減產和糧食重金屬含量超標。據(jù)《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國土壤環(huán)境狀況總體不容樂觀，總超標率為16.1%，而以重金屬為代表的無機污染物超標點位占全部超標點位的82.8%，其中土壤鉛、鎘點位超標率分別達1.5%和7.0%?？梢?，我國土壤重金屬污染形勢較為嚴峻，因此如何高效修復鉛鎘污染土壤、提升作物生產力，對保障糧食安全和耕地可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

生物質炭具有較好的土壤改良作用和較強的重金屬固定能力，已被學者們廣泛關注。生物質炭通常呈堿性、具有高度孔隙結構且富含芳香類有機物，有利于增加土壤有機碳，改善土壤結構和微生物生境，提高土壤微生物生物量和活性。巨大的比表面積、豐富的化學官能團和較強的離子交換能力等特性也賦予生物質炭較強的重金屬和有機污染物固定能力，從而使其可以降低污染物有效性，消減污染物對生態(tài)環(huán)境的危害效應。然而，生物質炭對土壤重金屬的修復效果與制備材料、熱解溫度、添加比例以及土壤性質等密切相關。目前，生物質炭施用對不同污染程度下土壤重金屬遷移性和生物有效性、作物累積重金屬特征的影響及其緩解植物重金屬脅迫等方面的作用已有廣泛報道。盡管多數(shù)研究表明生物質炭短期內可有效吸附和固定土壤中的重金屬，但其是否能有效緩解長期（如數(shù)十年）鉛鎘污染對土壤微生物活性的抑制作用、恢復微生物功能尚缺乏深入研究。

土壤微生物在養(yǎng)分轉化、提高作物生產力和重金屬修復等方面具有重要作用。土壤微生物對重金屬脅迫響應敏感，常用于指示土壤環(huán)境質量的變化。研究表明，重金屬污染可顯著抑制土壤微生物的生長與繁殖，改變群落組成，降低群落多樣性。重金屬污染進一步抑制土壤微生物活性，破壞其養(yǎng)分循環(huán)和物質分解功能。ZHU等總結發(fā)現(xiàn)，生物質炭可以促進細菌與重金屬之間的電子傳遞作用，進而促進重金屬的轉化，降低重金屬對土壤微生物的毒性。然而，不同類群微生物對重金屬污染和生物質炭添加的響應有所不同。LIANG等通過98 d的水稻盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，豬糞生物質炭對細菌較真菌、革蘭氏陰性菌較陽性菌類群有更好的促進作用，且顯著降低了稻米和秸稈中鉛、銅和砷的含量。張迪等的研究表明，生物質炭添加減輕了蘿卜和小白菜可食部位對鎘、鉛的富集，而且未影響土壤微生物群落多樣性。因此，闡明生物質炭修復重金屬污染過程對微生物組成和活性的影響特征，有助于更好地發(fā)揮生物質炭和土壤微生物在協(xié)同修復重金屬污染土壤方面的生態(tài)功能。

為此，本研究采集了3種長期（近50 a）受不同程度鉛鎘復合污染的農田土壤，通過盆栽試驗分析了生物質炭施用對土壤養(yǎng)分含量、鉛鎘有效性、土壤微生物豐度和活性的影響，旨在探明生物質炭對鉛鎘污染抑制土壤微生物活性的緩解作用，為生物質炭應用于污染土壤生態(tài)修復提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集與生物質炭制備

土壤樣品采自江蘇省宜興市宜豐鎮(zhèn)一塊稻麥輪作農田，該農田處于20世紀60年代末發(fā)展起來的一個金屬冶煉和加工產業(yè)區(qū)的下風向，受到長期不同程度的鉛鎘復合污染。該區(qū)域土壤類型為太湖地區(qū)第四紀湖積物發(fā)育的典型脫潛型水稻土——烏泥土。根據(jù)前期污染區(qū)域調研，在田塊中選擇低污染（LP）、中污染（MP）和高污染（HP）的3個區(qū)域，采集表層0~20 cm土壤，放入無菌塑料袋，帶回實驗室。土壤樣品挑去植物殘體，自然風干后過2 mm篩，混勻備用。

以當?shù)刎S富的山核桃蒲殼廢棄物為原料，將原料置于特制的密閉容器中，在馬弗爐中350℃限氧熱裂解4 h制備成試驗用生物質炭。制得的生物質炭磨細，通過1 mm篩，混合均勻后備用。

供試土壤和生物質炭基本性質如表1所示。

表1 供試土壤和生物質炭基本性質Table 1 Basic propertiesof tested soil and biochar

1.2 試驗設計

試驗設置鉛鎘污染（P）和生物質炭（C）兩個因子，其中鉛鎘污染設3個水平：低污染（LP）、中污染（MP）和高污染（HP）；生物質炭添加處理設3個水平：0（C0）、2%（C1）和4%（C2）（炭/土質量比），共得到9個處理。將生物質炭分別以0、2%和4%（炭/土質量比）的比例分別與上述3種土壤充分混合，裝入塑料盆（盆高和內徑均為20 cm），每盆裝土3 kg，每個處理3次重復。每盆播種20粒大小均勻飽滿的黑麥草種子作為指示植物，黑麥草種子萌發(fā)一周后，每盆間苗至8株。用去離子水調節(jié)土壤濕度至60%田間最大持水量（WHC）。盆栽試驗培養(yǎng)時間為90 d，培養(yǎng)期間不添加肥料以免混淆生物質炭對土壤微生物和植物的影響，定期補充去離子水。

1.3 土壤化學性質分析

盆栽結束后收集黑麥草地上部分，60℃烘干稱質量。采集土壤樣品，過2 mm篩，混勻，分成3份：一份自然風干，用于土壤化學性質測定；一份放在4℃冰箱保存，用于土壤呼吸和酶活性分析；剩余的一份冷凍干燥后保存至-70℃冰箱。土壤pH、有機碳（SOC）、全氮（TN）、堿解氮（AP）含量分析參照魯如坤的方法進行。土壤總鉛、總鎘含量采用HFHNO-HClO（10∶2.5∶2.5，∶∶）消煮，有效態(tài)鉛、鎘含量采用0.1 mol·LCaCl浸提，然后均用電感耦合等離子色譜儀（ICP-OES）測定。

1.4 土壤微生物磷脂脂肪酸分析

土壤微生物磷脂脂肪酸（PLFA）分析參考吳愉萍報道的方法。取4.0 g冷凍干燥后的土壤，用單相提取劑抽提土壤的脂質，采用SPE柱分餾出各類型的脂質，經(jīng)過對極性脂肪的甲酯化，形成磷脂脂肪酸甲酯。通過氣相色譜（Agilent 6890 N，美國）結合MIDI Sherlocks微生物識別軟件（Version 4.5，MIDI，美國）將PLFAs進 行 定 量 和 鑒 別。用C、C、C、C、C和C表 征 革 蘭 氏 陽 性 細 菌（G），C、C、C、C、C和C表 征 革蘭氏陰性細菌（G），C、C和C表征放線菌，C和C表征真菌。本研究中PLFAs總量為所列PLFA含量之和，F(xiàn)/B表示真菌與細菌的PLFA含量之比，C/C表示對細菌的脅迫效應[17-18]。

1.5 土壤脫氫酶活性、基礎呼吸和底物誘導呼吸的測定

土壤脫氫酶采用氯化三苯基四氮唑還原法測定，結果以每小時每克土壤中生成的三甲基甲臜量（μg·g·h）表示。土壤基礎呼吸測定參照CHEN等報道的方法：稱10 g土壤放入120 mL培養(yǎng)瓶中，調整土壤含水量至60%WHC，25℃恒溫好氧培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)結束后采集CO氣體，氣體樣品采用島津（Shimadzu，GC-2014，日本）氣相色譜儀測定（FID檢測器）。生成的CO用μg·g·h來表示。底物誘導呼吸測定方法參考基礎呼吸，開始培養(yǎng)前在每克土壤中加入30 mg葡萄糖（溶解在蒸餾水中），培養(yǎng)6 h后測定CO濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0軟件進行雙因素方差分析（Twoway ANOVA）（以重金屬污染和生物質炭處理為因子），Duncan法多重比較檢驗各因素處理間的差異顯著性，顯著性水平設為0.05。采用CANOCO軟件（CANOCO for Windows 4.5），利用土壤微生物PLFA含量數(shù)據(jù)進行群落結構與環(huán)境因子冗余分析（RDA）。采用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）檢驗鉛鎘污染（P）和生物質炭（C）處理及其交互作用（P×C）對微生物群落結構影響的顯著性。

2 結果與分析

2.1 土壤重金屬含量變化

雙因素方差分析結果表明，3種污染土壤中鉛、鎘總量和CaCl可提取態(tài)含量差異極顯著（<0.001）；生物質炭添加顯著降低了土壤總鉛含量，而對總鎘含量無影響（圖1）。生物質炭極顯著（<0.001）降低了可提取態(tài)鉛和可提取態(tài)鎘的含量，與CO相比，C1和C2在3種土壤中使可提取態(tài)鉛平均降低了65%和71%，使可提取態(tài)鎘平均降低了28%和52%。

圖1 生物質炭添加下3種污染土壤鉛鎘含量變化及雙因素方差分析結果Figure 1 Changes in Pb and Cd contents in three contaminated soils with biochar addition and results of two-way ANOVA

2.2 土壤化學性質和黑麥草生物量變化

雙因素方差分析結果表明，鉛鎘污染和生物質炭對SOC有顯著影響（表2）。生物質炭添加均顯著提高了3種土壤的pH、SOC、TN和C/N（<0.001）。鉛鎘污染與生物質炭對SOC和C/N具有顯著的互作效應，生物質炭施用對高污染土壤中SOC和C/N的提高程度更顯著。重金屬污染和生物質炭均顯著（<0.001）降低了土壤堿解氮含量，但兩者無互作效應。高、中濃度鉛鎘污染顯著（<0.001）降低了黑麥草生物量（分別平均降低28%和22%），但兩者間無顯著差異；生物質炭添加顯著（<0.001）提高了黑麥草生物量，且C2>C1，鉛鎘污染與生物質炭兩者無顯著互作效應。

表2 生物質炭處理下鉛鎘污染土壤化學性質和黑麥草生物量變化Table 2 Changes in soil propertiesand ryegrass biomass under Pb and Cd contamination and biochar treatments

2.3 土壤微生物PLFAs含量變化

雙因素方差分析顯示，與低污染土壤相比，中、高水平鉛鎘污染極顯著（=0.001）降低了土壤PLFAs總量，降低幅度平均分別為14%和24%（圖2）。相反，生物質炭添加極顯著（<0.001）提高了PLFAs總量，與CO相比，C1和C2使PLFAs總量平均提高了14.7%和30.8%。長期中、高水平鉛鎘污染顯著降低了土壤微生物PLFAs總量（分別為14%和24%）、G（34%和47%）和真菌數(shù)量（56%和57%），而生物質炭添加提高了上述菌群PLFAs含量。長期中、高水平鉛鎘污染顯著提高了細菌脅迫指數(shù)（178%和163%）和細菌/真菌比值（101%和82%）。相反，C1和C2兩種生物質炭處理顯著降低了細菌脅迫指數(shù)（14%和27%）和細菌/真菌比值（8%和19%）。

圖2 生物質炭添加下3種鉛鎘污染土壤磷脂脂肪酸含量變化及雙因素方差分析結果Figure 2 Changes in phospholipid fatty acid（PLFA）contents in three Pb and Cd contaminated soils with biochar addition and results of two-way ANOVA

2.4 土壤微生物群落結構變化

雙因素置換多元方差分析表明，鉛鎘污染極顯著（<0.001）改變了土壤微生物群落結構（圖3），生物質炭處理對土壤微生物群落結構也具有顯著（0.026）影響，但影響程度較鉛鎘污染小，兩者具有顯著的交互作用（0.031）。冗余分析表明，第一、第二軸分別解釋了土壤微生物PLFAs含量變異的72.5%和8.8%，兩者累積解釋度為81.3%。高污染土壤的微生物群落結構在第一軸上與其他兩種土壤具有明顯差異，且土壤鉛、鎘總量和CaCl提取態(tài)含量以及堿解氮含量是影響土壤微生物群落結構變異的主要因素。

圖3 生物質炭添加下3種鉛鎘污染土壤微生物群落結構冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of soil microbial community under biochar addition in three Pb and Cd polluted soils

2.5 土壤脫氫酶活性、基礎呼吸和底物誘導呼吸變化

如圖4所示，中、高污染土壤的基礎呼吸速率、底物誘導呼吸速率和脫氫酶活性比低污染土壤平均提高了48%、44%和190%。生物質炭添加也顯著提高了底物誘導呼吸和脫氫酶活性，但對土壤基礎呼吸速率無影響。生物質炭添加與鉛鎘污染對脫氫酶活性存在顯著的互作效應。

圖4 生物質炭添加下3種鉛鎘污染土壤基礎呼吸、底物誘導呼吸和脫氫酶活性及雙因素方差分析Figure 4 Changes in soil basal respiration，substrate-induced respiration and dehydrogenase activity under biochar addition and the results of two-way ANOVA

2.6 微生物活性與環(huán)境因子相關性分析

如表3所示，總鉛、總鎘、可提取態(tài)鉛和鎘含量與PLFAs總量（總鎘除外）和G/G比值呈顯著負相關（<0.05），而與細菌脅迫指數(shù)和細菌/真菌比值呈顯著正相關（<0.05）。土壤pH、SOC、TN和C/N與底物誘導呼吸和脫氫酶活性呈顯著正相關（<0.01，C/N與底物誘導呼吸除外）。

表3 微生物活性與環(huán)境因子相關性分析Table 3 Correlation analysis between soil microbial activity and environmental factors

3 討論

3.1 生物質炭對鉛鎘污染土壤重金屬和養(yǎng)分含量的影響

本研究所采集的土壤于20世紀60年代末受到冶金廢水污染，歷經(jīng)半個多世紀，土壤中鉛、鎘含量及有效態(tài)含量依然較高，尤其是高污染土壤，其鉛鎘含量超過農田土壤環(huán)境質量標準數(shù)倍。本研究測得的3種土壤鉛、鎘總量及可提取態(tài)鉛、鎘含量與LIU等在該地區(qū)發(fā)現(xiàn)的重金屬含量較為一致，因此能較好地表征長期不同鉛鎘污染程度?？商崛B(tài)重金屬的生物有效性較高，其含量降低對減弱植物對重金屬的吸收和積累及保障稻米安全具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，添加2%和4%質量比例的生物質炭均顯著降低了不同污染程度土壤中可提取態(tài)鎘和鉛的含量，表明生物質炭可有效降低鉛鎘的生物有效性。張迪等的研究表明，添加2.5%和5%質量比例的水稻秸稈生物質炭可使有效態(tài)鎘和鉛含量大幅度下降，并且促進鎘和鉛由酸溶態(tài)向還原態(tài)和殘渣態(tài)轉化。UCHIMIYA等的研究表明，生物質炭施用顯著提高了土壤對可溶態(tài)重金屬（銅、鎘、鎳）的固定，特別是提高了對鉛的固定。生物質炭降低可提取態(tài)鎘和鉛含量，一方面與其吸附固定能力有關，另一方面與其提高土壤的pH有關。生物質炭表面含有豐富的含氧官能團（如羧基、酚基、羰基、羥基、醌類物質等），具有較大的比表面積和較高的陽離子交換量，可以與重金屬形成表面絡合物以增加土壤對重金屬的專性吸附量，降低重金屬遷移率和生物有效性。提高土壤pH一方面可以促進土壤膠體和黏粒負電荷對重金屬離子的吸附能力，另一方面可以促進Cd、Pb與溶液中多余的OH形成沉淀，從而降低重金屬的有效性。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管3種污染土壤具有相近的土壤肥力狀況，但長期鉛鎘污染顯著降低了黑麥草生物量（表2），這可能與高水平鉛鎘污染提高了對植物的毒害作用，降低了土壤微生物數(shù)量和活性及養(yǎng)分周轉能力有關。有研究表明，重金屬污染可以通過抑制植物生長從而降低植物凋落物和根系分泌物等有機物輸入；另外也可以通過影響土壤微生物的活性和功能反過來降低土壤碳氮轉化速率，進而影響土壤有機質和氮素含量。ZHOU等利用整合分析發(fā)現(xiàn)，長期重金屬污染使土壤有機碳和全氮降低5%和17.9%，導致植物生長受到明顯抑制。本研究中，重金屬污染雖然使土壤有機碳有一定程度積累，但顯著降低了土壤微生物數(shù)量，如PLFAs總量和各個類群的豐度，因此可能影響了土壤微生物的養(yǎng)分周轉作用，進而使得黑麥草生長受到抑制。相反，活躍的微生物和土壤酶

活性有助于有機質礦化過程，保持土壤較高的養(yǎng)分周轉和供應。盡管長期鉛鎘污染對黑麥草生長具有抑制作用，但生物質炭添加顯著提高了污染土壤的黑麥草生物量，土壤有機碳、全氮，以及微生物豐度，表明生物質炭可通過改善和提高土壤肥力，降低鉛鎘有效性，從而降低重金屬對植物和微生物的毒害。

3.2 生物質炭對鉛鎘污染土壤微生物豐度和活性影響

有文獻報道，在重金屬污染初期，土壤微生物生物量顯著降低；而長期污染條件下這種抑制作用會逐漸減弱，但效果取決于污染物的種類和濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鉛鎘污染程度的升高，土壤微生物PLFAs總量和各個類群的豐度均顯著降低，不同污染程度土壤微生物群落結構差異顯著，說明長期的重金屬污染對土壤微生物生長仍具有明顯的抑制作用，并且會進一步改變微生物群落結構。盡管細菌和真菌等的PLFAs含量在重金屬污染下均有顯著下降，但是細菌/真菌比值卻顯著提高，表明真菌更易受到鉛鎘長期污染的影響，其對鉛鎘的脅迫耐受力較低。此外，G隨鉛鎘污染程度升高而顯著下降，表明G細菌更易受鉛鎘污染抑制，而G細菌反而更加適應了污染脅迫。C/C比值常用來指示細菌遭受環(huán)境脅迫的程度，其比值越大表示受環(huán)境脅迫越強。本研究中細菌脅迫指數(shù)隨鉛鎘污染程度加劇顯著提高，進一步表明鉛鎘污染對細菌類群存在明顯的抑制作用。與重金屬污染的脅迫作用截然相反，兩種水平的生物質炭添加均顯著提高了微生物PLFAs總量和各類群豐度，顯著降低了細菌脅迫指數(shù)和細菌/真菌比值，且這種改善作用在高污染土壤中更加明顯（圖2）。這些結果說明生物質炭施用可有效減輕長期重金屬污染對土壤微生物豐度的抑制作用。生物質炭施用通過改善土壤養(yǎng)分狀況和物理性質而提高農田土壤微生物豐度的研究已被廣泛報道，但長期重金屬污染脅迫下土壤微生物生物量的恢復和提高，一方面與生物質炭吸附和固定土壤中重金屬含量有關，尤其是生物有效態(tài)含量降低可直接減輕重金屬離子對微生物細胞的毒性。微生物PLFAs總量與可提取態(tài)鉛、鎘含量呈顯著負相關進一步印證了這一解釋。另一方面，生物質炭降低重金屬對土壤微生物的脅迫作用可能與生物質炭豐富的孔隙結構和較強的土壤養(yǎng)分固持能力有關。生物質炭的多孔隙結構及養(yǎng)分固持作用不僅給微生物提供了各種碳源、能源和礦物養(yǎng)分，而且營造了一個非常適宜的微生境，從而緩解重金屬的脅迫作用。

土壤呼吸和脫氫酶活性常用于表征土壤微生物的活性。ROMERO-FREIRE等發(fā)現(xiàn)，短期的重金屬污染可以顯著抑制土壤呼吸，而長期重金屬污染下土壤呼吸可恢復甚至提高。與短期的重金屬污染抑制作用不同，本研究發(fā)現(xiàn)，長期重金屬污染顯著提高了土壤基礎呼吸和底物誘導呼吸（圖4）。這可能是因為，長期的重金屬污染脅迫使得土壤微生物為了保持基本的代謝和繁殖水平，需要額外付出更多的能量以抵抗這種脅迫，從而以更高的呼吸速率反映出來。脫氫酶是一種胞內酶，其活性與微生物生物量有關。鉛鎘污染使脫氫酶活性提高也反映了土壤微生物對長期污染脅迫的適應性。生物質炭添加后土壤脫氫酶和底物誘導呼吸顯著提高，說明生物質炭能進一步解除重金屬的抑制作用，提高微生物活性。土壤呼吸與PLFAs的比值可表征單位微生物量的呼吸強度。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，鉛鎘污染使單位微生物量的呼吸強度顯著增加，而生物質炭施用的結果相反，表明生物質炭施用減輕重金屬對土壤微生物活性的抑制作用，使得微生物不需要額外消耗能量去克服重金屬脅迫，因此并不會導致生物質炭作用下土壤基礎呼吸加速。這一結果與細菌脅迫指數(shù)變化結果相印證。

4 結論

盡管長期（近50 a）鉛鎘污染對土壤微生物數(shù)量和活性具有明顯的抑制作用，但短期的生物質炭施用顯著降低了鉛鎘生物有效性，改善了微生物生境，顯著提高了微生物豐度，從而緩解了鉛鎘污染對微生物活性的抑制作用。因此，生物質炭不僅可以鈍化重金屬，而且有利于土壤微生物生態(tài)功能發(fā)揮，提高土壤生產力，可作為土壤重金屬污染修復材料。