寇鳳蓮，鄭金偉，鄭英敏，賀卓，盛下放，何琳燕*

（1.南京農業(yè)大學生命科學學院/農業(yè)農村部農業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室，南京 210095；2.南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095）

隨著工業(yè)的飛速發(fā)展和農藥、化肥的濫用，我國耕地重金屬污染程度日益加深，我國農田生態(tài)系統(tǒng)和農產(chǎn)品質量安全受到威脅。陳玉鵬等發(fā)現(xiàn)國內多個省市地區(qū)設施蔬菜集散地Cd、Pb污染嚴重，近30年來有大量蔬菜產(chǎn)品受重金屬污染情況的報道。在重金屬污染的土壤中施加具有離子吸附特性的鈍化劑可實現(xiàn)重金屬鈍化解毒修復功效，其中石灰、黏土礦物、生物炭等材料因具有調節(jié)土壤pH、吸附鈍化重金屬等特性而成為重金屬污染農田修復的主要材料，但其使用量通常較大，潛在二次污染風險也不容樂觀。

一些植物促生細菌被用于生物鈍化修復的研究和實踐。XU等發(fā)現(xiàn)菌株sp.X13顯著促進了白菜的生長，提高其生物量，并顯著降低了白菜地上部Cd含量。葛占標等應用B9使小白菜地上部Cd和Pb含量比不接菌對照分別顯著降低了24%和33%，B25使長葉萵苣地上部Cd和Pb含量比不接菌對照分別顯著降低了33%和35%。為了提高微生物在土壤中的存活率和修復效果，可將鈍化劑與微生物聯(lián)合使用。XIONG等利用惡臭假單胞菌X4/pIME與生物炭、稻草灰、石灰等復合處理Cd污染土壤，發(fā)現(xiàn)最佳處理組合能使生菜地上部Cd含量降低到0.14 mg·kg。賀卓等在田間小區(qū)試驗中發(fā)現(xiàn)細菌聯(lián)合海泡石能夠顯著降低辣椒和茄子果實中Pb含量，提高蔬菜品質。上述研究中采用的制劑多為實驗室豐富培養(yǎng)基制備的菌懸液，缺乏菌懸液的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化技術；且與固體菌劑相比，菌懸液在實際使用中運輸和保藏不方便。多數(shù)研究中菌懸液與固體鈍化劑聯(lián)合使用時，并沒有制備固體菌劑的過程，符合《農用微生物菌劑》（GB 20287—2006）的產(chǎn)品還很少見。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Cd耐性細菌H3菌株顯著降低了蔬菜地上部Cd、Pb含量和根際土壤有效態(tài)Cd含量，并增加了蔬菜地上部生物量。因此開展菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化，并配合常用重金屬鈍化劑研發(fā)重金屬阻控菌劑，通過田間小區(qū)試驗考察重金屬阻控菌劑減少蔬菜吸收Cd和Pb的效果和初步機制，為防控蔬菜積累重金屬、改善土壤生態(tài)環(huán)境提供科學理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌種：以本實驗室保藏的具有Pb、Cd抗性的芽孢桿菌H3（登錄號KP159386）為供試菌株。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，包含酵母膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基，包含蔗糖2.5 g、蛋白胨5.0 g、MgSO5.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。

試劑：蔗糖、玉米粉（購于安徽燕之坊食品有限公司）、糖蜜（購于廣西省柳州市金黔灣糖蜜有限公司）、酵母粉、硫酸銨、大豆粉（購于安徽燕之坊食品有限公司）、CaCO、MgSO?7HO、NaCl。

供試載體：生物炭（購于壽光禾能生物科技有限公司）為限氧裂解法制備的稻殼生物炭，顆粒直徑為0.5~1.0 mm，pH為（7.8±0.1），有機質含量（9.5±1.2）g?kg，C含量≥46.4%，N含量≥1.3%，O含量≥21.6%，表面積15.4 m?g，未檢測到Cd、Pb；海泡石（購于湘潭建聯(lián)豐禾生物科技有限責任公司）為天然海泡石，化學成分為Si和Mg，未檢測到Cd、Pb。供試載體均用80目試驗篩過篩備用。

供試蔬菜：意大利生菜（L.Hort.）購于江蘇農科院種子站。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)從斜面上挑取3環(huán)菌苔，接到裝有40 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、160 r?min振蕩培養(yǎng)20 h。

1.2.2 芽孢計數(shù)法

將發(fā)酵液在80℃水浴槽中熱處理20 min，然后采用十倍梯度稀釋、涂布培養(yǎng)、計數(shù)，測定芽孢數(shù)量。

1.2.3 菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化

采用單因子試驗、Plackett-Burman優(yōu)化試驗、最陡爬坡試驗和中心組合試驗對菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基進行優(yōu)化。單因子試驗：分別以玉米粉和糖蜜替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖，其他成分同初始發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選最佳碳源；分別以硫酸銨和大豆粉替代培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他成分不變，配制培養(yǎng)基，篩選最佳氮源；分別以硫酸鎂和碳酸鈣替代發(fā)酵培養(yǎng)基的氯化鈉，其他成分不變，配制培養(yǎng)基，篩選最佳無機鹽。將種子液接入上述培養(yǎng)基中，接種量為2%，30℃、160 r?min振蕩培養(yǎng)，于24、36、48、60、72 h取樣，測定發(fā)酵液中芽孢數(shù)量，以發(fā)酵液中芽孢數(shù)量作為篩選指標。

根據(jù)單因子試驗結果，考察糖蜜、大豆粉和碳酸鈣的添加量對芽孢數(shù)量的影響。利用Minitab 17軟件進行Plackett-Burman試驗設計及數(shù)據(jù)處理，每個因子取高、低兩個水平，以發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含量為低水平，初始含量的1.5倍作為高水平，試驗設計因素水平見表1。根據(jù)試驗結果，確定添加量影響顯著。以最陡爬坡試驗逼近最優(yōu)點的一組數(shù)據(jù)為中心點，設計2因素5水平中心組合試驗，具體設計見表2。按試驗所得數(shù)據(jù)進行二次多項回歸，擬合預測發(fā)酵芽孢數(shù)量最大值所對應的關鍵因子范圍。用所得到的最佳培養(yǎng)基進行3次平行試驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進而得出最終優(yōu)化結果。

表1 培養(yǎng)基成分Plackett-Burman設計因素水平（g?L-1）Table 1 Plackett-Burman design factor level of strain H3 medium composition（g?L-1）

表2 中心組合設計各因素水平（g?L-1）Table 2 Factor level of central composite design（g?L-1）

1.2.4 固體菌劑的制備

選用海泡石和生物炭作為載體，設置C1（海泡石）、C2（生物炭）、C3（生物炭50%+海泡石50%）3種處理。分別稱取載體10 g裝于搖瓶中，混合均勻后121℃間歇滅菌兩次。將種子液按2%接種量接種于上述優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r?min，振蕩培養(yǎng)48 h，獲得菌株H3發(fā)酵菌液。將發(fā)酵菌液按載體與發(fā)酵菌液比例1∶2（∶）加入載體中，160 r?min、30℃振蕩混合均勻，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，再在50℃下恒溫干燥，制得固體菌劑，常溫保存6個月。參照《農用微生物菌劑》（GB 20287—2006）中測定方法檢測菌劑中有效活菌數(shù)、雜菌數(shù)、水分、細度和pH。

1.2.5 固體菌劑阻控生菜吸收Pb、Cd試驗

在江蘇省南京市棲霞區(qū)某農田進行田間小區(qū)試驗，評價固體菌劑減少生菜Pb、Cd含量的作用。土壤基本理化性質如下：pH（6.92±0.03），有機質含量（22.50±1.20）g?kg，總Cd含量（1.83±0.10）mg?kg，總Pb含量（256.12±12.30）mg?kg。經(jīng)過人工除草、翻地、晾干、碎土和平整土地等處理后，用卷尺將區(qū)域分成12個試驗小區(qū)，每個小區(qū)面積為4 m（2 m×2 m），小區(qū)之間間隔20 cm。試驗設對照CK、H3發(fā)酵菌液（用量15 mL?m）、生物炭（用量15 g?m）、生物炭+菌株H3發(fā)酵菌液制成的固體菌劑C2（用量15 g?m）4個處理，每個處理重復3次，小區(qū)隨機排列。提前15 d將不同處理的材料均勻撒在小區(qū)土地上，與耕作層的土壤混勻。生菜種子經(jīng)75%酒精表面消毒5 min后，播種至裝有營養(yǎng)土的穴盤，置于光照溫室培養(yǎng)，定期間苗補水。15 d后移栽至各小區(qū)，常規(guī)田間管理。

收集長至成熟期的生菜植株，將植株連根帶土放入滅菌袋中，帶回實驗室。收集附著在根系表面的土壤，即根際土壤。土壤樣品放于室外自然風干，過80目試驗篩，篩出細度為20 mm的土壤樣品。按照WANG等的方法，用DTPA提取劑提取土壤樣品中有效態(tài)重金屬，并用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測定。土壤脲酶和蔗糖酶活性的測定參考關松蔭的方法。植物樣品經(jīng)0.01 mol?LEDTA-2Na溶液浸泡10 min和去離子水清洗后，分為地上部與根部，測定鮮質量，烘干、粉碎，用5%HNO消煮定容，用ICP-OES測定Cd、Pb含量。將新鮮生菜地上部研磨成勻漿，稀釋后離心并去除沉淀，上清液中Vc濃度用鉬藍比色法測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法

試驗中圖表繪制采用Excel和Graphpad Prism。利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析利用單因素ANOVA，<0.05表示差異顯著。Plackett-Burman優(yōu)化試驗和中心組合試驗設計與結果分析采用Minitab 17軟件。

2 結果與分析

2.1 菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 影響發(fā)酵液中芽孢數(shù)量的單因子試驗

碳源是細胞生長和新陳代謝必需的營養(yǎng)物質，其種類和濃度直接影響芽孢的形成速率和產(chǎn)量。選擇玉米粉和糖蜜作為蔗糖的替代碳源，其他成分保持不變，通過H3菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的芽孢數(shù)量曲線，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源，結果見圖1（A）。3種碳源下H3芽孢產(chǎn)量的大小順序為：糖蜜>蔗糖>玉米粉，糖蜜明顯優(yōu)于其他碳源。以糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中菌株H3在48 h達到最大芽孢數(shù)4.0×10CFU?mL。

氮源主要作用是構成菌體細胞物質和合成含氮代謝物，在形成芽孢上也發(fā)揮著重要的作用。選擇大豆粉、硫酸銨作為蛋白胨的替代氮源，其他成分保持不變，結果見圖1（B）。3種氮源下H3芽孢產(chǎn)量的大小順序為：大豆粉>硫酸銨>蛋白胨，以大豆粉為氮源的培養(yǎng)基中菌株H3最大芽孢數(shù)達到3.8×10CFU?mL。

無機鹽是菌體細胞中組成酶的激活劑或抑制劑的成分之一，可以用來調節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH等。選擇碳酸鈣、硫酸鎂作為氯化鈉的替代無機鹽，其他成分保持不變。由圖1（C）可知，碳酸鈣作為無機鹽時，發(fā)酵液中H3芽孢數(shù)量遠大于硫酸鎂和氯化鈉培養(yǎng)基，且在48 h達到最大芽孢數(shù)4.9×10CFU?mL。

圖1 不同碳源、氮源和無機鹽對菌株H3芽孢數(shù)量的影響Figure 1 Effectsof different carbon sources，nitrogen sources and inorganic ions on the spores number of strain H3

2.1.2 Plackett-Burman優(yōu)化試驗分析

單因子試驗篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳碳源為糖蜜，氮源為大豆粉，無機鹽為碳酸鈣。通過Minitab 17軟件設計Plackett-Burman試驗，初步優(yōu)化菌株H3發(fā)酵培養(yǎng)基的3種成分，不同組合的發(fā)酵液中芽孢數(shù)量結果見表3，各因素水平及效應評價見表4。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)回歸分析可以得到擬合回歸方程：=4.308+0.508+0.608+0.942（為芽孢數(shù)量，為糖蜜，為大豆粉，為碳酸鈣）?；貧w模型的<0.01，說明模型所建立的回歸方程能很好地表達糖蜜、大豆粉及碳酸鈣3個因素之間的關系?；貧w方程中效應值的絕對值大小決定各因素對H3芽孢數(shù)量影響程度，即碳酸鈣>大豆粉>糖蜜，而且各因素對H3芽孢數(shù)量的影響均為正效應，因此糖蜜應取高水平值（3.80 g?L）。大豆粉和碳酸鈣值均小于0.05，即大豆粉和碳酸鈣對H3芽孢數(shù)量具有顯著影響。選定對響應值具有顯著效應且為正效應的大豆粉和碳酸鈣進行下一階段最陡爬坡試驗，調整水平范圍。

表3 Plackett－Burman試驗設計與結果Table 3 Design matrix and experimental resultsof Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman試驗設計回歸分析結果Table 4 Regression analysis by Plackett-Burman test design

2.1.3 最陡爬坡試驗和中心組合試驗分析

根據(jù)Plackett-Burman優(yōu)化試驗結果可知，大豆粉及碳酸鈣是影響發(fā)酵液芽孢數(shù)量的關鍵因素，且是正效應，應依次增大，進行爬坡試驗，結果見表5。隨著爬坡試驗步長增加，芽孢數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當培養(yǎng)基中大豆粉為9.5 g?L、碳酸鈣為9.5 g?L時，對應的發(fā)酵液芽孢數(shù)量達到最大值，將其作為中心組合試驗的響應面區(qū)域中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計和結果Table 5 Test design and results of steepest ascent path

根據(jù)最陡爬坡試驗結果，采用Minitab 17軟件進行二次回歸的中心組合設計，進一步優(yōu)化顯著因素的含量?；貧w分析結果見表6。依據(jù)中心組合試驗結果，得到二次擬合回歸方程為：=6.140-0.485-0.012-1.907-1.157-0.000（為芽孢數(shù)量，為大豆粉，為碳酸鈣）。對二次模型進行方差分析，結果見表6。模型的值為13.97，多元決定系數(shù)=0.908 9，模型擬合度較高。回歸模型的=0.002，模型的擬合極顯著，所建立的回歸方程能很好地表達大豆粉和碳酸鈣2個因素之間的關系。采用Minitab 17軟件對中心組合試驗配方優(yōu)化（圖2），結果顯示大豆粉9.25 g?L、碳酸鈣9.50 g?L時，響應值達到最大值。

圖2 中心組合試驗響應面優(yōu)化圖Figure 2 Response surface optimization diagram of central composite design

表6 中心組合試驗設計回歸分析結果Table 6 Regression analysis based on central composite design

經(jīng)過5次驗證試驗，H3在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基中形成芽孢數(shù)平均值為5.9×10CFU?mL，與預測值較為吻合，表明芽孢形成數(shù)目模型的準確性較高。較優(yōu)化前（2.3×10CFU?mL）提高156%，相應的H3最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為糖蜜3.80 g?L，大豆粉9.25 g?L，碳酸鈣9.50 g?L。

2.2 固體菌劑指標測定結果

《農用微生物菌劑》（GB 20287—2006）產(chǎn)品技術指標中指出，粉劑微生物菌劑在保藏第6個月后，有效活菌數(shù)要求達到2.0×10CFU?g，雜菌率≤20%，水分≤35%，細度高于80%，pH控制在5.5~8.5范圍內?？紤]到有機鈍化劑類的有機肥可能存在的重金屬、抗生素等二次污染風險，顆粒狀有機肥與菌懸液不容易混勻，以及本試驗場地的土壤有機質含量較高[（22.50±1.20）g?kg]等原因，本研究選取海泡石和生物炭兩種無機鈍化劑作為載體，與菌懸液制備固體菌劑。表7為兩種無機載體與菌株H3發(fā)酵液復配制成的固體菌劑C1（海泡石）、C2（生物炭）、C3（生物炭50%+海泡石50%）在保藏6個月后相關指標檢測結果。供試菌劑C1、C2和C3的細度都符合要求，C2和C3的有效活菌數(shù)、pH、雜菌率和水分均達到標準，且C2有效活菌數(shù)高于C3，雜菌率顯著低于C3。有效活菌數(shù)為微生物菌劑檢測的重要指標，根據(jù)農用微生物菌劑的相關指標，選擇C2作為后續(xù)田間試驗施用的固體菌劑。

表7 微生物菌劑指標測定Table 7 Determination of microbial agent index

2.3 固體菌劑減少蔬菜吸收Pb、Cd的田間試驗效果

2.3.1 不同處理對生菜生物量和Vc含量的影響

在田間小區(qū)試驗中，與對照相比，3種處理均能促進生菜可食用部分干質量和Vc含量增加，其中固體菌劑C2和H3菌液分別顯著增加了生菜可食用部分干質量89.9%和44.9%[圖3（A）]，菌株H3與生物炭協(xié)同促生作用明顯。3種處理的生菜Vc含量比對照顯著增加19.1%~39.5%，H3菌液對生菜Vc含量增加效果好于生物炭和固體菌劑C2[圖3（B）]（0.05）。

圖3 H3發(fā)酵菌液、生物炭、固體菌劑C2處理對生菜可食用部分干質量和Vc含量的影響Figure 3 Effects of H3 fermentation broth，biochar，solid bacteria agent C2 treatment on the biomassand Vc content in fresh edible tissue of lettuce

2.3.2 不同處理對生菜可食用部分Cd和Pb含量的影響

從圖4看出，不同處理均能降低生菜可食用部分Cd、Pb含量。4種處理的生菜可食用部分Cd含量表現(xiàn)為C2<生物炭

圖4 H3發(fā)酵菌液、生物炭、固體菌劑C2處理對生菜可食用部分Cd和Pb含量的影響Figure 4 Effects of H3 fermentation broth，biochar，solid bacteria agent C2 treatment on Cd and Pb content in fresh edible tissue of lettuce

2.3.3 不同處理對土壤有效態(tài)Cd、Pb含量和酶活性的影響

從圖5（A）、圖5（B）看出，與對照相比，3種處理均能顯著降低生菜根際土壤有效態(tài)Cd和Pb含量，分別降低了14.2%~32.7%和10.4%~11.1%。其中，固體菌劑C2降低根際土重金屬生物有效性的效果較好，與對照相比，根際土有效態(tài)Cd和Pb含量分別顯著降低32.7%和11.1%。與對照相比，生物炭、菌株H3以及固體菌劑C2均能顯著增加生菜根際土壤脲酶和蔗糖酶活性[圖5（C）、圖5（D）]，其中固體菌劑C2處理的生菜根際土壤脲酶和蔗糖酶活性比對照顯著增加60.8%和143.7%。

圖5 H3發(fā)酵菌液、生物炭、固體菌劑C2處理對生菜根際土壤DTPA提取態(tài)Cd和Pb含量、脲酶和蔗糖酶活性的影響Figure 5 Effects of H3 fermentation broth，biochar，solid bacteria agent C2 treatment on the DTPA extractable of Cd and Pb，urease activity and invertase activity in lettuce rhizosphere soils

3 討論

3.1 產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化

芽孢的形成與菌種有關，同時還受到營養(yǎng)物質及環(huán)境因素的影響。因此，培養(yǎng)基成分、含量以及發(fā)酵條件的選擇對促進芽孢的生成至關重要。響應面分析法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子與試驗結果（響應值）的關系函數(shù)化，研究因子與響應值、因子與因子之間的相互關系，并進行優(yōu)化。近年來運用響應面分析法來優(yōu)化芽孢桿菌產(chǎn)胞培養(yǎng)基的報道較多，均取得了比較好的結果。劉清術等對巨大芽孢桿菌1013培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)為（89.34±3.87）×10CFU?mL，比基礎培養(yǎng)基提高了3.35倍。本研究采用響應面法優(yōu)化菌株H3產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基，將發(fā)酵芽孢數(shù)提高到5.9×10CFU?mL，較初始培養(yǎng)基芽胞數(shù)提高了156%。優(yōu)化后培養(yǎng)基采用糖蜜、大豆粉作為碳、氮源，原材料廉價易得，生產(chǎn)成本降低，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

3.2 土壤修復菌劑降低蔬菜重金屬含量、修復污染農田效果

近年來，受污染農田的安全利用得到多方重視，重金屬污染農田修復材料和蔬菜安全生產(chǎn)技術成為研究熱點之一。以微生物菌劑為核心的農田土壤調理劑、修復劑等產(chǎn)品的研發(fā)和應用報道較多，但以在實驗室水平上開展為主。能夠分泌IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶的Cd抗性細菌H3在盆栽試驗中能夠促進小白菜生長，且定殖在小白菜根際土壤后能顯著降低根際土壤有效態(tài)Cd/Pb含量，提高土壤蔗糖酶活性，從而顯著降低小白菜地上部Cd、Pb含量。本研究田間試驗中，菌株H3和固體菌劑C2均能增強土壤脲酶和蔗糖酶活性，顯著降低根際土壤DTPA提取態(tài)Cd和Pb含量，減少生菜吸收重金屬，說明菌株H3具有穩(wěn)定的修復作用。固體菌劑C2的有效活菌數(shù)、pH、雜菌率和水分均達到農用微生物菌劑產(chǎn)品技術指標標準，后續(xù)研究中需擴大應用范圍和使用面積，開展生態(tài)風險和安全使用管理研究，以適應修復菌劑產(chǎn)品大幅增長需求。

本研究中各處理均減少了蔬菜中Cd、Pb含量，效果表現(xiàn)為固體菌劑C2>H3菌液>生物炭，可見固體菌劑C2協(xié)同了H3菌液和生物炭的作用，可能與土壤脲酶活性增強、有效態(tài)Pb、Cd含量降低有關。土壤脲酶對土壤和肥料的氮素轉化起著重要作用，能夠使尿素轉化為氨態(tài)氮，從而使土壤氨含量增加。FISHER等的研究表明，脲酶產(chǎn)生菌和脲酶基因豐度的提高可以提高土壤pH值，YANG等的研究表明，具有脲酶活性的細菌與土壤氮代謝密切相關，能夠提高土壤銨離子含量和pH值。此外，HAN等發(fā)現(xiàn)菌株CL-1能夠提高根際土壤中精氨酸脫羧酶產(chǎn)生菌相對豐度和多胺含量，從而提高土壤pH、降低土壤有效態(tài)Cd含量。因此，固體菌劑C2和H3菌液降低土壤有效態(tài)Cd、Pb含量還可能與其分泌精氨酸脫羧酶有關。

生物炭作為土壤改良劑被廣泛應用，其不僅能夠通過提高土壤的pH值來降低重金屬的生物有效性，還可以通過陽離子吸附作用降低其在土壤中的遷移，同時生物炭能夠通過改善和提高土壤肥力降低重金屬對植物的毒害?？紤]到生物炭多孔性和營養(yǎng)作用，可以將其作為載體材料制備固體菌劑。王瀟敏等通過室內培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)中性小麥秸稈炭可作為膠凍樣芽孢桿菌較理想的載體。CHEN等利用熱重分析、XRD、SEM和XPS等物理化學手段研究發(fā)現(xiàn)，堿性富磷生物炭可以保護細菌sp.免受高Cd危害，生物炭多孔性能夠保護細胞，同時堿性有利于碳酸鎘和磷酸鎘礦物形成，降低Cd毒害。本研究制備的固體菌劑C2中，菌株H3在生物炭中存活率高于海泡石中，且生物炭雜菌率低于海泡石，可見生物炭可以起到保護細胞的作用。在田間試驗中，固體菌劑C2也表現(xiàn)出良好的降低土壤Cd、Pb生物有效性效果，并增強根際土壤脲酶和蔗糖酶活性。多位研究者也發(fā)現(xiàn)此效應，TU等發(fā)現(xiàn)生物炭負載sp.NT-2比單一生物炭使用更能提高土壤pH值，降低交換態(tài)和碳酸鹽結合態(tài)Cd、Cu含量，提高土壤脲酶和蔗糖酶活性，提升土壤微生物多樣性指數(shù)，且多糖能強化sp.NT-2與玉米秸稈生物炭的黏附。CHENG等在田間試驗中發(fā)現(xiàn)CL-1和生物炭復合處理可以降低小麥籽粒Cd和Pb含量，主要原因是單菌處理、生物炭與菌株復合處理可以增加小麥根際腐胺含量和基因A拷貝數(shù)，提高土壤pH值，降低小麥根際土壤Cd生物有效性以及根-籽粒轉移系數(shù)。今后應深入研究生物炭-微生物-重金屬的相互作用，長期定位監(jiān)測和評估生物修復效果，以期為揭示生物炭負載細菌修復劑鈍化重金屬的機理提供更多依據(jù)。

4 結論

（1）菌株H3產(chǎn)胞培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌株H3在產(chǎn)胞培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，芽孢數(shù)量可達5.9×10CFU?mL，芽孢數(shù)較原始培養(yǎng)基顯著提高了156%，生產(chǎn)成本降低，原材料廉價易得，配合常用重金屬鈍化劑研發(fā)重金屬阻控菌劑，能夠適于大規(guī)模應用。

（2）生物炭與H3菌液制成的固體菌劑C2保藏6個月后，有效活菌數(shù)仍能保持在2×10CFU?g以上，雜菌率低于20%，各項指標均達到國家農用微生物菌劑要求，為以微生物菌劑為核心的農田土壤調理劑、修復劑等產(chǎn)品的研發(fā)和應用提供技術支持。

（3）固體菌劑C2處理后生菜根際土有效態(tài)Cd和Pb含量分別顯著降低32.7%和11.1%，生菜可食用部分Cd和Pb含量分別顯著降低35.2%和50.1%，且根際土壤脲酶和蔗糖酶活性比對照顯著增加60.8%和143.7%，菌劑在保障蔬菜安全生產(chǎn)方面具有廣闊的應用前景，為防控蔬菜積累重金屬、改善土壤生態(tài)環(huán)境提供技術支持。