席曉萌，姜云鴿，王煜丹，黃相中，田 凱

(1.云南民族大學(xué) 理論與計算化學(xué)實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

糖尿病是一種以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的疾病，以慢性高血糖為主要特征.糖尿病發(fā)病原因有很多，但是主要原因多涉及環(huán)境、遺傳以及生活方式等[1].自從 2 000 年糖尿病地圖集面世至今，該疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)出日益高發(fā)的態(tài)勢，給全球造成了巨大的公共衛(wèi)生壓力.在眾多的慢性疾病中，其對人類的危害，僅次于心血管疾病和癌癥[2-4].一旦患上這種疾病，機體內(nèi)的多種物質(zhì)，比如水、脂肪、蛋白質(zhì)等，其代謝都將出現(xiàn)異常，胰島素合成減少，血糖升高，長此以往，眼、腎、神經(jīng)等多臟器的功能水平都將受到影響而降低.糖尿病會導(dǎo)致人的食欲增強，飲水量增加，小便增多，體重不斷降低，即所謂的“三多一少”[5-8].糖尿病包括多種類型，從致病根源上來看包括了1型、2型糖尿病，以及妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病，相比之下，1型和2型患者占比更高，尤其是2型，超過 90%的患者都屬于2型，并且發(fā)病年齡日趨年輕化[6, 9-10].糖尿病患者一經(jīng)發(fā)病，往往很難治愈，只能終生服用各類降糖類藥物.傳統(tǒng)降糖藥毒性較大，長期服用往往給患者身體造成嚴(yán)重的傷害，因此研制新型的、高效的、低毒的抗糖尿病藥物是目前的主流研究.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念是由來自英國的Hopkins教授于2007年率先提出的[11]，其主要借助系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)和計算機技術(shù)等先進手段，通過藥物對集體的干預(yù)實現(xiàn)對疾病詳細(xì)而準(zhǔn)確的判斷和解釋，然后在利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)錁?gòu)建模型，以此對不同節(jié)點的相關(guān)性與作用機理實施分析[12-13].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近些年新興的一種基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，它首先對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)分析，以特定信號節(jié)點(Nodes)為基準(zhǔn)，最終設(shè)計并研究多靶點藥物分子的一門新學(xué)科.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表示，要從多個途徑上對信號通路進行調(diào)節(jié)，確保藥物的最佳療效，減小毒副作用，提高新藥在臨床上的成功率，節(jié)約研發(fā)費用.所以，從某種意義上講，它是從全新的角度去認(rèn)識藥物和機體的相互作用關(guān)系，以及闡釋疾病與藥物關(guān)聯(lián)的計算方法.

黃酮泛指通過一個三碳原子實現(xiàn)2個酚羥基的苯環(huán)(A環(huán)，B環(huán))的聯(lián)結(jié)，由此所形成的若干種化合物，其基本母核為2-苯基色原酮.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團.此外，它還常與糖結(jié)合成苷[14].黃酮類化合物廣泛存在于天然的植物和中草藥中，正是依賴于這些中草藥，使黃酮類化合物的獲取變得相對容易，給研究開展提供了便利(常見黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式見表1).

研究表明，黃酮類化合物的生理活性與藥理活性都相對較多，在抗炎癥、抗氧化、抗糖尿病并發(fā)癥以及抗癌癥等方面都能夠產(chǎn)生一定的療效[15-17].黃酮類化合物擁有毒性低的特點，在一些食物或者化妝品中都有添加.近幾年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)葛根異黃酮類化合物具有降血糖、降血脂及擴張冠狀血管的作用[18]；梅桂雪等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可以通過抑制 Maillard 反應(yīng)、增強機體對葡萄糖的攝取、促進胰島素的分泌、作用于血管緊張素等，發(fā)揮防治糖尿病的作用；葛根素可以使鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖明顯降低，促進胰腺胰島素受體底物以及生長因子的蛋白水平上升，進而促進胰島素分泌能力的提升[18].Cheng等[20]對水飛薊的藥用機理進行分析，指出其能夠使沉默信息調(diào)節(jié)因子表達能力下降，使胰腺β細(xì)胞的自我吞噬受到抑制，從而使血糖水平趨于正常，同時它還能對機體胰島淀粉樣多肽的毒性低聚反應(yīng)形成抑制，避免其出現(xiàn)纖維化，進一步增強胰島β細(xì)胞活力，減輕糖尿病的癥狀.

表1 常見的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式

1 資料與方法

1.1 黃酮類化合物靶點篩選及預(yù)測

論文中所用到的6個黃酮均來自云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點實驗室在辣木、半育耳蕨、野番豆等藥材中分離獲得的黃酮類化合物.將上述化合物分別用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件畫出，保存為sdf格式文件.

聯(lián)網(wǎng)打開Swiss ADME(http://www.swissadme.ch/)數(shù)據(jù)庫，將這6個黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)依次導(dǎo)入其中，檢測其藥代動力學(xué)參數(shù).通過查閱文獻，選擇 GI absorption為High，P-gp substrate為Yes，再選一個參數(shù)為Yes作為篩選這些小分子的方法，即“1High，2Yes”[21].通過初步篩選，發(fā)現(xiàn)這6個黃酮類化合物均符合藥代動力學(xué)參數(shù)規(guī)則，因此將其分別命名為HT-1-HT-6.具體的結(jié)構(gòu)信息見表2.將上述經(jīng)過初步篩選的6個化合物依次導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫中，分別獲取它們所對應(yīng)的靶基因.將化合物靶點數(shù)據(jù)保存為Excel表格形式.

表2 6個黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)信息表

1.2 檢索人2型糖尿病相關(guān)基因

聯(lián)網(wǎng)打開GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“Type 2 Diabetes Mellitus”為關(guān)鍵詞預(yù)測2型糖尿病相關(guān)靶點，隨后將2型糖尿病靶點數(shù)據(jù)保存為Excel表格形式.

1.3 獲取黃酮類化合物-2型糖尿病交集基因

將上述獲得的6個小分子Excel表格中“Common name”一列單獨粘貼至一個全新的Excel表格中，以“Probability”這一欄大于零作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，如果存在可能性為0的數(shù)據(jù)，需要將此數(shù)據(jù)的Common name刪去，最后剔除重復(fù)的數(shù)據(jù)；

將下載好的2型糖尿病靶點信息Excel表格中“Gene Symbol”單獨粘貼至一個全新的Excel表格中，剔除重復(fù)的數(shù)據(jù)；

圖1 6個黃酮類化合物與2型糖尿病交集靶點韋恩圖

聯(lián)網(wǎng)打開Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)數(shù)據(jù)庫，將篩選后的黃酮類化合物和2型糖尿病的靶基因?qū)肫渲校纯傻玫竭@6個黃酮類化合物與2型糖尿病的交集靶點，共收集到201個交集靶點,如圖1所示.

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

聯(lián)網(wǎng)打開String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，將上述獲得的201個交集基因?qū)肫渲?，選擇高置信度(highest confidence0.900)解析，可以得到原始的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示.將原始PPI網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，選取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度(Degree，Deg)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和介數(shù)中心性(Betweenness Centrality，BC)等指標(biāo)作為量化節(jié)點，Degree、CC和BC值越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要[22].從中選取大于Degree、CC和BC三者值的中位數(shù)的化學(xué)成分和靶點分別作為關(guān)鍵化學(xué)成分和核心靶點，即為黃酮類化合物治療2型糖尿病的關(guān)鍵化學(xué)成分和核心靶點.以這些核心靶點和關(guān)鍵化學(xué)成分為基礎(chǔ)，做出蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)與成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖.

1.5 GO生物富集分析和KEGG通路富集分析

R語言是一款強大生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理的半編程軟件，主要用于統(tǒng)計分析、繪圖、數(shù)據(jù)挖掘.它可以靈活調(diào)用后臺開發(fā)的集成包，支持?jǐn)U展包的安裝及更新[23].本論文采用R語言clusterProfiler[24]包進行富集分析.

將交集基因?qū)胫羢ymbol2id文件夾中Drug_Disease.txt文檔中，聯(lián)網(wǎng)打開R語言程序，R x64 3.6.3，調(diào)用org.Hs.eg.db指令將交集基因的Symbol轉(zhuǎn)化為Entrez IDs，進一步調(diào)用clusterProfiler包對靶點基因進行GO生物富集分析和KEGG通路分析.物種設(shè)置為人，P<0.05作為富集篩選的標(biāo)準(zhǔn)，取排名前20的數(shù)據(jù)，利用Rstudio中的ggplot2包進行繪圖.

2 研究結(jié)果

2.1 黃酮類化合物及2型糖尿病的相關(guān)靶點

通過篩選整理，6個天然黃酮類化合物共獲得600個靶點基因，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)，一共獲得235個靶點基因；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選整理，共獲得了 10 735 條關(guān)于2型糖尿病相關(guān)的靶點.

2.2 藥物化學(xué)成分-2型糖尿病蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將原始的PPI網(wǎng)絡(luò)文件通過Cytoscape3.8.0軟件基于Degree、combined score值等參數(shù)的構(gòu)建，即可得到黃酮化合物-2型糖尿病相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示.網(wǎng)絡(luò)中共有201個節(jié)點和514條邊，網(wǎng)絡(luò)平均自由度為5.11.

圖2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系原始圖 圖3 黃酮化合物-2型糖尿病PPI網(wǎng)絡(luò)圖

該圖中，根據(jù)Degree值設(shè)置圖形的大小及顏色的深淺，Degree值越大，圖形越大，顏色也越深，說明與蛋白聯(lián)系越密切；Combine score值越高，邊就越粗，說明與蛋白相互作用的越好.

從圖中可以看到顏色較深的幾個蛋白，例如：PIK3CA、PIK3R1、MAPK3等均屬于網(wǎng)絡(luò)中前20的節(jié)點，在整個網(wǎng)絡(luò)圖中十分重要.

2.3 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

將6個黃酮類化合物共計235個靶點基因與2型糖尿病的 10 735 個靶點基因取交集之后，得到201個交集靶點基因.利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建化學(xué)成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖如圖4所示(黃色菱形結(jié)構(gòu)代表藥物成分；綠色倒三角形結(jié)構(gòu)代表靶點；藍色六邊形結(jié)構(gòu)代表疾病).網(wǎng)絡(luò)中一共有241個節(jié)點(其中6個節(jié)點屬于黃酮類化合物，235個節(jié)點屬于靶點)；度值較高的化合物有HT-2、HT-3、HT-6等.上述提及的黃酮化合物對醫(yī)治2型糖尿病可能具有一定功效.

圖4 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

利用R語言程序的org.Hs.eg.db包和clusterProfiler包對201個交集基因進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，201個交集基因共影響了146個生物功能(P<0.05,FDR<0.05)，選取排名前20位靶基因功能信息，詳見圖5(柱狀圖中柱形區(qū)域越長，表明該生物功能富集的基因越多；顏色越紅，表示P值越小，結(jié)果越顯著)、表3.

圖5 GO功能富集柱狀圖(排名前20名)

表3 GO功能富集分析表(排名前20名)

續(xù)表3

由表2可知，本論文中所使用的黃酮化合物主要富集在蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、羧酸酯水解酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、組蛋白激酶活性、胰島素受體底物結(jié)、SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合、碳氧裂解酶活性、水解裂合酶活性、裂合酶活性、鈣依賴性磷脂酶A2活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合和磷脂酰肌醇3-激酶結(jié)合，這充分表明本論文選取的黃酮類化合物是通過多種生物學(xué)途徑發(fā)揮治療2型糖尿病的作用.

通路富集分析發(fā)現(xiàn)，201個交集基因顯著富集在了159條通路上(P<0.05,FDR<0.05)，選取排名前20位靶基因功能信息，詳見圖6(柱狀圖中柱形區(qū)域越長，表明該通路富集的基因越多；顏色越紅，表示P值越小，結(jié)果越顯著)、表4.

圖6 KEGG通路富集柱狀圖(排名前20名)

表4 KEGG通路富集分析表(排名前20名)

由表3可知，KEGG通路富集中，與腫瘤相關(guān)的有14條，分別是：前列腺癌、Ras信號通路、胰腺癌、急性髓樣白血病、非小細(xì)胞肺癌、癌癥中的蛋白聚糖、VEGF信號通路、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、磷脂酶D信號通路、ErbB信號通路、HIF-1信號通路、癌癥的中樞碳代謝、黑素瘤、結(jié)直腸癌；與2型糖尿病有關(guān)的通路有3條，分別是：PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、內(nèi)分泌抵抗；與炎癥相關(guān)的通路有2條，分別是：花生四烯酸代謝、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路；以及其它1條信號通路：脂質(zhì)與動脈粥樣硬化.圖7是與2型糖尿病關(guān)系最為密切的PI3K-AKT信號通路完整示意圖.

圖7 PI3K-AKT信號通路圖

3 討論

文中應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究了實驗室分離得到的黃酮類化合物與2型糖尿病相互作用的機制.通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫的篩選與預(yù)測，獲得了化合物與疾病的靶基因，進一步得到了兩者的交集基因；通過Cytoscape軟件構(gòu)建了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)與成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖；通過R語言半編程程序?qū)患蜻M行生物功能富集與通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些黃酮類化合物是通過多種生物學(xué)途徑及影響多條信號通路來發(fā)揮治療2型糖尿病的作用，明確了黃酮化合物在基因水平上作用于2型糖尿病的機制.相關(guān)的較為重要的信號通路有PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性，接下來就以上述通路具體展開說明其作用機制.

磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K-AKT)信號通路是一條十分重要的通路，該通路不但可以調(diào)節(jié)機體的胰島素信號傳導(dǎo)，而且是胰島素下游的信息通路，有效參與機體內(nèi)一些生物學(xué)途徑，例如：細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡及葡萄糖轉(zhuǎn)化等.如果PI3K-AKT信號通路出現(xiàn)異常，那么人體中的胰島素合成及釋放信號就會受到影響，從而導(dǎo)致胰島素不能正常唯機體所使用，進一步誘發(fā)機體罹患2型糖尿病[25].人體內(nèi)有很多重要的信號蛋白，胰島素受體底物-2(IRS-2)是其中一種，該蛋白可使胰島β細(xì)胞保持良好的生物學(xué)活性，能促進胰島β細(xì)胞的新生與復(fù)制，關(guān)系到胰島β細(xì)胞的存活與凋亡.當(dāng)胰島素與相關(guān)受體特異性結(jié)合后，會使得IRS-2酪氨酸位點磷酸化，進而與PI3K的P85調(diào)節(jié)亞基發(fā)生結(jié)合，這樣一來下游的PI3K分子將被活化，產(chǎn)生磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸；與此同時，活化后的 PI3K 分子可以充當(dāng)?shù)诙攀沟纳矸荩T導(dǎo)產(chǎn)生AKT 活化效應(yīng).活化后的 AKT 可導(dǎo)致FoxO1磷酸化失活，F(xiàn)oxO1是胰島β細(xì)胞團的關(guān)鍵調(diào)控因子，其一旦失活，機體內(nèi)的G6P基因和PEPCK表達就會受到影響，糖異生途徑受到抑制，血糖因此而降低[26-27].

多數(shù)研究表明，糖尿病和肺癌發(fā)病率增高有關(guān)[28].表皮生長因子受體(epidermal growth factorreceptor，EGFR) 的靶向治療是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的主要治療手段之一，目前臨床上最常用的非小細(xì)胞肺癌靶向治療藥物之一就是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其中比較有代表性的藥物有第1代的厄洛替尼，第2代的阿法替尼，第3代的奧西替尼等.通過查閱相關(guān)文獻和報道，發(fā)現(xiàn)厄洛替尼可以降低血糖，并且能逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗.Costa 等[29]報道了1例72歲的NSCLC老年女性患者，確診肺癌時已有兩年糖尿病病史，在服用了厄洛替尼后并進行醫(yī)學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)該患者的血糖和糖化血紅蛋白(ALC)指數(shù)明顯降低；此外，針對EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性，也有學(xué)者做了相關(guān)研究：眾所周知，二甲雙胍是一類降糖療效出色的藥物，一些研究學(xué)者認(rèn)為二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性.楊翠等[30]研究認(rèn)為二甲雙胍能夠逆轉(zhuǎn)肺腺癌耐厄洛替尼細(xì)胞A549ER耐藥性.另外，上文中提到的PI3K-AKT 通路是 EGFR的主要下游靶點.

綜上所述，本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建了黃酮類化合物治療2型糖尿病的成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖及PPI圖，明確了6個黃酮類化合物通過多靶點、多通路治療2型糖尿病的作用機制.