呂 典，冷露芬，張 琪，王阿英，賴 祺，易春蝶，馬燕華，尹俊林，曾廣智

(云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500)

結(jié)腸癌(colorectal canser，CRC)是全球第3大常見癌癥，其死亡率居全球第2[1].目前有效的診斷方式和治療措施使結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率得到了下降[2-3]，但術(shù)后5年生存率仍小于50%[4]，且患者發(fā)病率呈年輕化趨勢[1]，嚴(yán)重威脅到人們的生命健康.所以探索結(jié)腸癌治療方法和開發(fā)結(jié)直腸藥物仍具有重要意義.

常山屬(DichroaLour.)植物屬于虎耳草科的小屬，共有12種，分布從亞洲南部大陸到太平洋島嶼，其中有6種存在我國華南和印度[5].常山屬植物主要含有生物堿[6]、香豆素[6]、多酚[7]和甾體[8]等成分，具有抗瘧疾[9]、抗病毒[10]和抗腫瘤[11]等生物活性.目前對于硬毛常山(DichroahirsutaGagnep.)的研究相對較少，本研究從硬毛常山中分離得到的化合物(E)-6-(4-羥基苯基)-庚-3-烯-2-酮(EHP)化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1.發(fā)現(xiàn)其對人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15具有較好的增殖抑制活性，探討了其對人結(jié)直腸癌HCT-15的增殖抑制作用和機(jī)理，發(fā)現(xiàn)EHP主要通過細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞的凋亡，抑制了人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞增殖.

圖1 EHP化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人宮頸癌細(xì)胞Hela、人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(中科院昆明植物所)；RPMI 1640、DMEM、胰酶、PBS(BBI，中國)；0.4%結(jié)晶紫(索萊寶，中國)；臺盼藍(lán)試劑盒(碧云天，中國)；RIPA裂解液、凋亡試劑盒、周期試劑盒(翊圣，中國)；CDK1、CDK2、CDK4、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1、P53、P27、P21、PARP 1、cleaved PARP 1、Caspase 9、active Caspase 9、Caspase 3、active Caspase 3、GADPH和β-actin(Proteintech，中國).3425型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國)；垂直電泳儀(Bio-rad，美國)；TS-2000A搖床(Kulin-bell，中國)；SpectraMax i3x型微孔板檢測器(Molecular Devices，美國)；DMIL LED型倒置顯微鏡和DMI8型熒光倒置顯微鏡(徠卡，德國).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela和MDA-MB-231用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，HCT-15用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于 37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).根據(jù)不同細(xì)胞生長情況、傳代數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài)約 3 d 傳代一次，以維持細(xì)胞良好生長狀態(tài).

1.3 SRB檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的Hela、HCT-15和MDA-MB-231細(xì)胞以5×103個/孔，鋪于96孔板，37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h.按照4、20、100 μmol/L 濃度配制EHP，加入96孔板中，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白和DMSO溶劑對照，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h.加入50%TCA固定細(xì)胞1h，洗板，晾干，4%SRB染色 0.5 h，洗板，晾干，加入 4 mmol/L Tris溶液，搖床 5 min，515 nm 多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度，根據(jù)結(jié)果計算細(xì)胞活力.

1.4 臺盼藍(lán)染色

取對數(shù)生長期的HCT-15細(xì)胞以1.2×105個/孔鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h.按照10、20、50 μmol/L 濃度配制EHP，加入12孔板，同時設(shè)置空白對照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h.收集細(xì)胞，臺盼藍(lán)以濃度0.4%重懸細(xì)胞，染色 3 min，血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)或拍照，計算細(xì)胞存活率.

1.5 平板克隆

取對數(shù)生長期的HCT-15細(xì)胞以200個/孔，鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約 3 d，直至形成肉眼可見細(xì)胞團(tuán).按照10、20、50 μmol/L 濃度配制EHP，加入12孔板，同時設(shè)置空白對照，繼續(xù)培養(yǎng) 10 d.收板，加無水乙醇固定 15 min，0.4%結(jié)晶紫染色 5 min，顯微鏡下觀察，并用相機(jī)拍照.

1.6 細(xì)胞周期和Western blot實驗

取對數(shù)生長期的HCT-15細(xì)胞以1.2×105個/孔，鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h.按照10、20、50 μmol/L 濃度配制EHP，加入12孔板，同時設(shè)置空白對照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h.收細(xì)胞，70%乙醇固定細(xì)胞過夜，PI染色，37 ℃ 孵育 30 min，流式細(xì)胞儀檢測.

收集HCT-15細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，按比例加入5×loading buffer.將各蛋白上樣于10%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，PVDF膜濕法轉(zhuǎn)印.5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h.2%脫脂奶粉稀釋一抗CDK1(1∶3 000)、CDK2(1∶4 000)、CDK4(1∶3 000)、Cyclin A2(1∶4 500)、Cyclin B1(1∶3 500)、Cyclin D1(1∶3 000)、Cyclin E1(1∶3 000)、P53(1∶3 000)、P27(1∶3 000)、P21(1∶3 000)、GADPH(1∶15 000)和β-actin(1∶15 000)于 4 ℃ 過夜孵育，TBST洗膜，2%脫脂奶粉稀釋二抗(1∶7 000)室溫下孵育 2 h，TBST洗膜.最后，ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液顯影，于化學(xué)發(fā)光顯影儀檢測蛋白條帶，同時進(jìn)行半定量灰度分析.

1.7 凋亡和Western blot實驗

取對數(shù)生長期的HCT-15細(xì)胞以1.2×105個/孔，鋪于12孔板，37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h.按照 100 μmol/L 終濃度配制EHP，40 μmol/L 終濃度配制凋亡抑制劑Z-VAD-FAM，5 μmol/L 終濃度配制喜樹堿(CPT)，各組分別以 100 μL EHP、50 μL EHP+50 μL Z-VAD-FAM、100 μL CPT體積加入12孔板，同時設(shè)置空白對照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h.收細(xì)胞，V-FITC和PI染色，室溫、避光孵育 15 min，流式細(xì)胞儀檢測.

收集HCT-15細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，按比例加入5×loading buffer.將各蛋白上樣于10%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，PVDF膜濕法轉(zhuǎn)印.5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h.2%脫脂奶粉稀釋一抗PARP 1(1∶4 000)、cleaved PARP 1(1∶3 000)、Caspase 9(1∶3 500)、active Caspase 9(1∶3 000)、Caspase 3(1∶3 000)、active Caspase 3(1∶2 500)、GADPH(1∶15 000)和β-actin(1∶15 000)于 4 ℃ 過夜孵育，TBST洗膜.2%脫脂奶粉稀釋二抗(1∶7 000)室溫下孵育 2 h，TBST洗膜.最后，ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液顯影，于化學(xué)發(fā)光顯影儀檢測蛋白條帶，同時進(jìn)行半定量灰度分析.

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行，3次獨立重復(fù)實驗，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.000 1.

2 結(jié)果

3次獨立重復(fù)實驗，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001.

2.1 EHP抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

SRB實驗檢測EHP對Hela、HCT-15和MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力，與對照組相比，EHP在20、100 μmol/L 濃度下，顯著抑制細(xì)胞增殖，在 4 μmol/L 濃度下沒有明顯的抑制作用(圖2A)，根據(jù)不同濃度下細(xì)胞抑制率，計算出EHP對Hela、HCT-15和MDA-MB-231細(xì)胞作用 48 h 時，IC50分別為21.67±1.49、13.61±0.71、25.67±1.33 μmol/L，可以得出其對人結(jié)直腸癌HCT-15抑制效果最明顯.

對不同EHP摩爾濃度下的HCT-15進(jìn)行臺盼藍(lán)染色(圖2B)，隨著EHP摩爾濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，且皺縮.對平板克隆結(jié)果進(jìn)行觀察(圖2C)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞集落隨著EHP摩爾濃度增加減少，且形成集落中細(xì)胞數(shù)量也明顯減少.這些結(jié)果說明EHP以摩爾濃度依賴性抑制HCT-15細(xì)胞的增殖.

圖2 EHP對HCT-15的增殖抑制影響

2.2 EHP誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞G2阻滯

流式細(xì)胞儀檢測不同濃度EHP作用下，HCT-15周期各個時期變化(圖3A和3B)，3次獨立重復(fù)實驗,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異,*表示p<0.05,**表示p<0.01.與對照組相比，隨著EHP濃度增加G1期減少，S期整體呈下降趨勢，G2明顯增加(表S1)，說明EHP誘導(dǎo)HCT-15阻滯在G2期.此外，EHP促進(jìn)HCT-15細(xì)胞中CDK1、CDK2、Cyclin B1和Cyclin E1蛋白表達(dá)，抑制CDK4、Cyclin A2、Cyclin D1蛋白表達(dá)(圖3C和D)，進(jìn)一步說明了EHP抑制HCT-15細(xì)胞增殖發(fā)生G2期阻滯.

圖3 EHP對HCT-15細(xì)胞周期的影響

2.3 EHP誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測 100 μmol/L EHP作用下，HCT-15細(xì)胞凋亡情況(圖4A和4B)，3次獨立重復(fù)實驗,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素One-way ANOVA檢驗分析兩組間顯著性差異,*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<0.001,****表示p<0.0001.與空白對照組相比，細(xì)胞凋亡明顯，這與陽性藥CPT作用結(jié)果相同；加入凋亡抑制劑Z-VAD-FAM，EHP作用下的HCT-15凋亡得到緩解，結(jié)果說明Z-VAD-FAM凋亡抑制劑發(fā)揮了抑制HCT-15的凋亡作用，進(jìn)一步證明了EHP誘導(dǎo)了HCT-15的凋亡作用.此外，WB檢測結(jié)果(圖4C和4D)顯示，EHP抑制PARP1、Caspase 3、Caspase 9蛋白的表達(dá)，促進(jìn)cleaved PARP1、active Caspase 3、active Caspase 9蛋白的表達(dá)，且濃度較高時增強(qiáng)和抑制效果均更為顯著，這些實驗說明EHP誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞發(fā)生凋亡.

圖4 EHP對HCT-15細(xì)胞凋亡的影響

圖5 EHP對HCT-15細(xì)胞中P53通路的影響

2.4 EHP抑制p53通路蛋白表達(dá)

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度EHP下調(diào)細(xì)胞周期上游調(diào)控因子P53、P27和P21的表達(dá)，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(見圖5)，3次獨立重復(fù)實驗,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素One-way ANOVA檢驗分析2組間顯著性差異,*表示p<0.05,**表示p<0.01. 說明EHP可能通過影響P53通路的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖.

3 討論

結(jié)直腸癌是我國常發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅的人們生命安全.手術(shù)和放化療等醫(yī)學(xué)治療方式的不斷發(fā)展，使結(jié)直腸癌致死率得到緩解[2-3].然而復(fù)發(fā)率仍然很高，化療耐藥性是其復(fù)發(fā)的一個主要原因[12-13].因此尋找結(jié)直腸癌治療的其他藥物顯得尤為重要.硬毛常山屬于常山屬，關(guān)于其報道相對較少，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)硬毛常山中單體化合EHP具有較好的抗腫瘤效果，特別是可以顯著抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15的增殖.本研究發(fā)現(xiàn)，EHP能抑制HCT-15細(xì)胞中P53通路蛋白表達(dá)，促進(jìn)CDK1、CDK2、Cyclin B1和Cyclin E1蛋白表達(dá)，抑制CDK4、Cyclin A2、Cyclin D1蛋白表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G2期，同時誘導(dǎo)其凋亡.

細(xì)胞周期調(diào)控著細(xì)胞的增殖、復(fù)制和分裂進(jìn)程，主要有3個調(diào)控點：G1到S期、S到G2期和G2到M期，分別受不同的基因和蛋白調(diào)控[14].細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)通過使周期蛋白磷酸化而形成復(fù)合物，其中形成CDK4/6-Cyclin D1復(fù)合物在G1期進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，在G1后期到S期CDK2-Cyclin E1/A2復(fù)合物是必須的，而CDK1- Cyclin B1復(fù)合物主要在G2期發(fā)揮作用.有報道呋喃二烯酮誘導(dǎo)RKO和HT-29細(xì)胞G0/G1期阻滯，主要通過降低CDK4、CDK6、Cyclin D1、CDK2和Cyclin E1，伴隨著P21上調(diào)實現(xiàn)的[15].在本實驗中，在EHP作用下，HCT-15腫瘤細(xì)胞G1期和S期比例下調(diào)，同時檢測到CDK2和Cyclin E1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而CDK4 和Cyclin D1表達(dá)被抑制，并且與CDK2具有結(jié)合作用的 Cyclin A2表達(dá)也是減弱.在本實驗中，同時發(fā)現(xiàn)EHP促進(jìn)HCT-15細(xì)胞中CDK1和Cyclin B1蛋白表達(dá)，綜合以上結(jié)果表明EHP誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯.

P53是重要的抑癌基因，是周期檢測途徑中關(guān)鍵性的蛋白[16]，P53的激活可能導(dǎo)致G1或G2期阻滯.研究表明，P53缺乏(突變或缺失)能誘導(dǎo)G2/M期阻滯，并且在P53缺失的細(xì)胞中，其作用途徑從P21依賴轉(zhuǎn)變成Chk依賴[17-19].CDK相互作用蛋白1(P21)和激酶抑制蛋白1(P27)屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的CIP/KIP蛋白家族[20-21].研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)P21表達(dá)被阻滯時，地西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯[22].P27和P21一樣可以與CCND1-CDK4/6復(fù)合物相互作用[23]，但是會造成對CCNE-CDK2復(fù)合物抑制的阻斷[24].在本實驗中，EHP抑制腫瘤細(xì)胞HCT-15中突變P53的表達(dá)，同時導(dǎo)致P21和P27的表達(dá)降低，從而促進(jìn)CDK2、Cyclin E1、CD1和Cyclin B1的表達(dá)，G1含量降低，誘導(dǎo)G2期阻滯.但CDK4和Cyclin D1蛋白表達(dá)卻下降，可能存在其他調(diào)節(jié)作用.

細(xì)胞凋亡是1種細(xì)胞程序性死亡，主要包括兩種途徑：死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[25].Caspase 9是細(xì)胞凋亡的發(fā)起者，充當(dāng)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的多種蛋白激酶信號傳導(dǎo)途徑的焦點；Caspase 3 是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，多種凋亡刺激因子啟動不同的蛋白酶切割Caspase 3，使其激活，活化的Caspase 3進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)放大，細(xì)胞走向凋亡；PARP是細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶(caspase)的切割底物，在DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用.有研究發(fā)現(xiàn)Oridinin以劑量依賴性活化Caspase 3，Caspase 9和PARP-1的切割，從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的凋亡[27].在本實驗中，不同濃度EHP作用下，HCT-15發(fā)生凋亡作用，這與陽性藥CPT效果一致，同時用Caspase凋亡抑制劑Z-VAD-FMK進(jìn)行凋亡抑制，EHP誘導(dǎo)凋亡得到緩解.接著檢測得出凋亡相關(guān)蛋白PARP 1、Caspase 9和Caspase3表達(dá)量均下降，且cleaved PARP、Caspase 9和Caspase 3 活性蛋白含量增加.說明EHP通過激活Caspase 9，從而進(jìn)一步激活Caspase 3，在體內(nèi)，PARP 1經(jīng)Caspase 3剪切失去活性，無法對DNA進(jìn)行修復(fù)，從而導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞發(fā)生凋亡.

綜上所述，本研究通過對硬毛常山中提取的單體化合物EHP進(jìn)行抗結(jié)直腸癌HCT-15的研究，發(fā)現(xiàn)EHP通過調(diào)節(jié)P53通路，誘導(dǎo)HCT-15發(fā)生G2阻滯和凋亡作用，抑制增殖.該研究結(jié)論為(E)-6-(4-羥基苯基)庚-3-烯-2-酮(EHP)在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制以及新的治療藥物開發(fā)提供了新的理論資料.