黎玉瓊，郭亞男，2*,牛曉昊，2，黃 亮

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；3.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏銀川 750021)

犢牛腹瀉是犢牛養(yǎng)殖中極其常見的一種病癥，也是犢牛培育過(guò)程中的重要難題，很容易造成犢牛生長(zhǎng)發(fā)育不良[1]。由于其具有較高的發(fā)病率和死亡率，因此每年給肉牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)極大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。引起犢牛腹瀉的病因極其復(fù)雜，包括感染性因素和非感染性因素[2]。非感染性因素主要包括飼喂不當(dāng)、護(hù)理不當(dāng)或飼養(yǎng)環(huán)境惡劣等飼養(yǎng)管理方面的因素[4]；感染性因素主要包括產(chǎn)毒素性大腸埃希氏菌、沙門氏菌、輪狀病毒、冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、隱孢子蟲以及球蟲等的感染，臨床上常呈現(xiàn)2種以上病原的混合感染[4-5]。犢牛發(fā)生腹瀉時(shí)，養(yǎng)殖技術(shù)人員常主觀判斷病因?yàn)榇竽c埃希氏菌、沙門氏菌等細(xì)菌感染，以及輪狀病毒等病毒感染，忽視或不大考慮寄生蟲感染如賈第鞭毛蟲、球蟲和隱孢子蟲。事實(shí)上，在臨床中引起犢牛腹瀉的原因較為復(fù)雜，包括犢牛自身免疫力、所處環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)以及傳染性因子等多種因素，是這些因素相互作用的結(jié)果。因此，準(zhǔn)確及時(shí)診斷犢牛腹瀉的病因尤為重要。

奶牛和肉牛產(chǎn)業(yè)為寧夏地區(qū)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，在國(guó)內(nèi)肉牛和奶牛養(yǎng)殖量和養(yǎng)殖水平上均名列前茅，但是犢牛腹瀉問(wèn)題一直是困擾養(yǎng)殖戶的重要難題之一。因此，本研究通過(guò)對(duì)寧夏地區(qū)10個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)0～60日齡132份頭腹瀉犢牛糞便樣本進(jìn)行隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲和球蟲進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查，旨在掌握寧夏地區(qū)致犢牛腹瀉的主要病原體及常發(fā)年齡段，為犢牛腹瀉病的診斷和治療及疾病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 BoviD-5 Ag Test Kit(輪狀病毒、冠狀病毒、隱孢子蟲、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲)(RG1302DD)，韓國(guó)安捷公司產(chǎn)品；氯化鈉，天津市鼎盛鑫化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 麥?zhǔn)舷x卵計(jì)數(shù)板(A3875)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所產(chǎn)品；顯微鏡(CX31)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便采集 通過(guò)直腸采集腹瀉犢牛糞便，記錄牛場(chǎng)、牛號(hào)、出生日期。共采集了10個(gè)規(guī)模化牛場(chǎng)0～60日齡犢牛糞便共計(jì)132份。

1.2.2 病原檢測(cè) 輪狀病毒、冠狀病毒、隱孢子蟲、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲檢測(cè)：用棉簽收集糞便，將糞便插入試管并攪拌10次，室溫靜止1 min，用吸管小心吸取上清液并加入4滴混合液，10 min后判斷結(jié)果。

球蟲檢測(cè)：根據(jù)麥克馬斯特法[6]計(jì)算每克糞便中的卵囊數(shù)(oocysts per gram of feces，OPG)。取糞便2 g，放入燒杯中，先加水5 mL，攪拌混勻后，加飽和食鹽水至60 mL，混勻后用銅篩網(wǎng)過(guò)濾，吸取糞液，注入麥克馬斯特計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置5 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)2個(gè)刻度室中的卵囊數(shù)。2個(gè)計(jì)數(shù)室的蟲卵數(shù)的平均值乘以200，即為每克糞便中的蟲卵或卵囊數(shù)(OPG=(n1+n2)/2/0.15×60/2 =A×200 其中(n1+n2)/2為平均每個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)卵囊數(shù)A，0.15為每個(gè)計(jì)數(shù)室有效體積為0.15 mL，60為糞液總體積為60 mL，2為所用糞便克數(shù)為2 g)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel軟件對(duì)檢測(cè)到的不同病原體進(jìn)行單一感染率、混合感染率、發(fā)病時(shí)間和時(shí)間軸進(jìn)行初步分析；采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)分析軟件中的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同牧場(chǎng)6種病原檢測(cè)結(jié)果

不同牧場(chǎng)腹瀉犢牛6種病原檢出病原數(shù)、病原種類和檢出率見表1。132份樣品中共檢出95份陽(yáng)性糞便，6種病原平均檢出率為71.96%。不同牧場(chǎng)檢出率各不同，最低檢出率33.33%，最高檢出率為100%。牧場(chǎng)1、3、4、5、6、10病原檢出率差異不顯著(P>0.05)；牧場(chǎng)2、7與牧場(chǎng)1、6、10病原檢出率差異顯著(P<0.05)；牧場(chǎng)8、9與牧場(chǎng)2、6、10病原檢出率差異極顯著(P<0.01)。

表1 不同牛場(chǎng)腹瀉犢牛6種病原檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同病原陽(yáng)性率

通過(guò)對(duì)不同病原檢出結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示，95份陽(yáng)性樣本中，隱孢子蟲感染樣本38份，占40.00%；輪狀病毒感染樣本41份，占43.16%；冠狀病毒感染樣本33份，占34.74%；大腸埃希氏菌K99感染樣本3份，占3.16%；賈第鞭毛蟲感染24份，占25.26%；艾美耳球蟲感染樣本5份，占5.26%。隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒之間的樣本陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)；隱孢子蟲和輪狀病毒樣本陽(yáng)性率與大腸埃希氏菌K99樣本陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)；賈第鞭毛蟲樣本陽(yáng)性率與隱孢子蟲、輪狀病毒、大腸埃希氏菌K99、球蟲樣本陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)。

表2 6種病原陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 單一感染和混合感染統(tǒng)計(jì)分析

在檢出的陽(yáng)性樣品中，單一感染陽(yáng)性樣品共58份，占61.05%。其中隱孢子蟲所占比例最大，占21.05%(20/95)；輪狀病毒占13.68%(13/95)，賈第鞭毛蟲12.63%(12/95)，冠狀病毒占6.32%(6/95)，大腸埃希氏菌K99占6.32%(3/95)。隱孢子蟲陽(yáng)性率與冠狀病毒和大腸埃希氏菌陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)；輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲、球蟲之間的陽(yáng)性率所占比例差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2種病原混合感染樣品共27份，占28.42%。其中輪狀病毒和冠狀病毒占10.53%(10/95)，比例最大；隱孢子蟲和輪狀病毒占6.32%(6/95)；輪狀病毒和賈第鞭毛蟲占2.11%(2/95)；冠狀病毒和賈第鞭毛蟲占6.32%(6/95)；隱孢子蟲和冠狀病毒占3.16%(3/95)。輪狀病毒和冠狀病毒混合感染陽(yáng)性率與輪狀病毒和賈第鞭毛混合感染蟲陽(yáng)性率、隱孢子蟲和冠狀病毒混合感染陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)(表3)。

3種病原混合感染樣本共10份，占10.53%。其中隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒占7.37%(7/95)；隱孢子蟲、輪狀病毒、賈第鞭毛蟲占2.11%(2/95)；隱孢子蟲、冠狀病毒、賈第鞭毛蟲占1.05%(1/95)。不同3種病原混合感染樣本陽(yáng)性率之間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 6種病原混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 不同疾病發(fā)病日齡統(tǒng)計(jì)分析

6種病原最早發(fā)病時(shí)間和常發(fā)日齡如圖1所示。隱孢子蟲最早發(fā)病日齡為5日齡，常發(fā)日齡在5日齡～21日齡。冠狀病毒最早發(fā)病日齡為5日齡，常發(fā)日齡在5日齡～27日齡。輪狀病毒最早發(fā)病日齡為5日齡，常發(fā)日齡在5日齡～18日齡。賈第鞭毛蟲最早發(fā)病日齡為8日齡，常發(fā)日齡在24日齡～60日齡；球蟲最早發(fā)病日齡為30日齡，在犢牛整個(gè)生命周期中均可發(fā)??；大腸埃希氏菌最早發(fā)病日齡為0日齡，常發(fā)日齡為0～7日齡。

圖1 6種疾病常發(fā)時(shí)間軸

3 討論

麥克馬斯特氏法檢測(cè)糞便球蟲卵囊數(shù)雖然是比較傳統(tǒng)的方法，但是該方法不僅可以準(zhǔn)確地觀察到球蟲，而且可以對(duì)球蟲種類進(jìn)行直觀的形態(tài)學(xué)觀察和卵囊大小的測(cè)量。因?yàn)榕袛嗲蛳x病不僅要檢測(cè)球蟲數(shù)量，還要檢測(cè)致病性蟲種。該方法成本最低，而且檢測(cè)時(shí)間較短，視為球蟲檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99和賈第鞭毛蟲為初生犢牛常發(fā)的腹瀉性病原，這幾種病原的快速檢測(cè)可以達(dá)到針對(duì)疾病精準(zhǔn)治療,降低犢牛死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失的目的。本研究采用膠體金病原檢測(cè)試紙進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，10 min～15 min即可快速檢出病原。

本研究對(duì)引起0～60日齡內(nèi)犢牛腹瀉的6種病原進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)132份樣品共檢出95份陽(yáng)性糞便，6種病原平均檢出率為71.96%。10個(gè)牧場(chǎng)檢出率各不相同，最低檢出率33.33%，最高檢出率為100%。其中，隱孢子蟲占40.00%，輪狀病毒占43.16%，冠狀病毒占34.74%，大腸埃希氏菌K99占3.16%，賈第鞭毛蟲占25.26%，艾美耳球蟲占5.26%，說(shuō)明犢牛腹瀉病原中輪狀病毒比例最大，其次是隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、球蟲和大腸埃希氏菌。隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒之間的樣本陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)；隱孢子蟲和輪狀病毒樣本陽(yáng)性率與大腸埃希氏菌K99樣本陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)；賈第鞭毛蟲樣本陽(yáng)性率與隱孢子蟲、輪狀病毒、大腸埃希氏菌K99、球蟲樣本陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)。本研究結(jié)果與王文佳等[1]2017對(duì)寧夏部分地區(qū)犢牛腹瀉4病原調(diào)查中的輪狀病毒比例最大，其次是隱孢子蟲等結(jié)果一致，但本研究的結(jié)果多出了冠狀病毒和球蟲檢測(cè)結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，單一感染陽(yáng)性樣品中隱孢子蟲所占比例最大，其次是輪狀病毒、賈第鞭毛蟲、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99；隱孢子蟲陽(yáng)性率與冠狀病毒和大腸埃希氏菌陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)；輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲、球蟲之間的陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)。2種病原混合感染中以輪狀病毒和冠狀病毒所占比例最大，其次是隱孢子蟲和輪狀病毒、輪狀病毒和賈第鞭毛蟲、冠狀病毒和賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲和冠狀病毒；輪狀病毒和冠狀病毒混合感染陽(yáng)性率與輪狀病毒和賈第鞭毛混合感染蟲陽(yáng)性率、隱孢子蟲和冠狀病毒混合感染陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)。3種病原混合感染中隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒比例最大，其次是隱孢子蟲、輪狀病毒、賈第鞭毛蟲，隱孢子蟲、冠狀病毒、賈第鞭毛；不同3種病原混合感染樣本陽(yáng)性率之間差異不顯著(P>0.05)。本研究說(shuō)明隱孢子蟲在單一感染中為主要發(fā)病病原。輪狀病毒和冠狀病毒為混合感染的主要病原。但是0～30日齡犢牛球蟲病發(fā)病率極低，主要是其他5種病原。3種病原混合感染中以隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒混合為主，因此犢牛腹瀉病原中應(yīng)主要注意隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒這3種病原引起的腹瀉，對(duì)于賈第鞭毛蟲和球蟲等寄生蟲性腹瀉應(yīng)采取環(huán)境消毒、保持圈舍清潔和早期驅(qū)蟲等措施來(lái)預(yù)防控制疾病的發(fā)生。

本研究通過(guò)對(duì)不同日齡犢牛6種病原流行病學(xué)調(diào)查，首次建立了適合寧夏地區(qū)的6中常見病原的最早發(fā)病時(shí)間和常發(fā)日齡圖譜，可為寧夏地區(qū)犢牛腹瀉的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。