田 野，朱 杰，陳 玲，杜鵬飛

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東濱州 256600)

雞滑液支原體(Mycoplasmasynoviae, MS)可引起雞和火雞的呼吸道感染及傳染性滑膜炎等病癥，它可通過直接接觸或呼吸道進(jìn)行水平傳播，也可以垂直傳播，近年來在我國雞群中廣泛流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，MS只有一個血清型，因此需要通過基因分型進(jìn)一步明確MS的流行情況。通過MS基因型進(jìn)行溯源分析，對于制定有效的預(yù)防、控制和根除MS的策略是至關(guān)重要的。常用的方法是通過VlhA基因進(jìn)行分型，這是一種簡單、經(jīng)濟(jì)的分型方式，但是區(qū)分度不足，適用于初步研究[1]。目前，EL-Gazzar等[2]建立了多位點序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)方法，依靠多個管家基因積累的突變點進(jìn)行分型，具有較好的分型效果。本研究針對2016-2021年間分離的MS菌株進(jìn)行測序，同時結(jié)合NCBI基因庫中的國內(nèi)外MS菌株的數(shù)據(jù)進(jìn)行MLST分型并建立進(jìn)化樹，以明確國內(nèi)MS流行株所屬的基因型及相互之間的進(jìn)化關(guān)系，為我國養(yǎng)雞業(yè)的MS防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 樣品為來自山東、四川、河北、湖北、遼寧、安徽、江蘇、黑龍江、寧夏共9省份疑似爆發(fā)MS感染雞場的雞腿、拭子等病料。

1.2 主要試劑 氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等鹽類購自國藥集團(tuán)，支原體培養(yǎng)基采用改良Frey氏培養(yǎng)基(購自O(shè)XOID)，輔酶購自羅氏。細(xì)菌DNA提取試劑盒和PCR mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌株的分離、純化及鑒定 將關(guān)節(jié)液或拭子溶解在MS液體培養(yǎng)基中，通過0.45 μm濾器過濾除菌。將過濾液在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)1～3 d，待變色后保種。將培養(yǎng)物10倍倍比稀釋，選取合適的稀釋度接種支原體固體培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d后挑取單菌落，按同樣方法進(jìn)行3代的純化后，使用明膠蔗糖保護(hù)劑進(jìn)行凍干保種。通過OIE推薦的MS特異性引物進(jìn)行分離株的鑒定(MS1-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA；MS2-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA)[3]。

1.4 多位點序列基因分型

1.4.1 DNA提取 取純化保種的MS凍干菌種復(fù)溶，按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行MS分離株基因組模板的提取，置于-20 ℃條件下暫存。

1.4.2 引物合成 MLST引物參考El-Gazzar M等[2]建立的MLST方法設(shè)計，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物信息Tab 1 Primer information

1.4.3 MLST目的基因擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，上游引物F(10 μmol/L) 2 μL，下游引物R(10 μmol/L)2 μL，ddH2O 18 μL，DNA模板3 μL，共50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，共45個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取8 μL PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.4.4 測序及序列分析 將PCR產(chǎn)物送往生工生物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果用Bio Edit進(jìn)行編輯處理。

1.4.5 MLST分型 用DNAstar Lasergene7.1將測序的片段進(jìn)行比對、剪切掉多余部分。整理后的Adk、Ppa、Gmk、nagC、Efp、atpG、recA測序片段在PubMLST官網(wǎng)上進(jìn)行等位基因的查找(https:∥pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_msynoviae_seqdef&page=sequenceQuery)，并根據(jù)7個等位基因確定ST型(https:∥pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_msynoviae_seqdef&page=profiles&scheme_id=1)。

1.4.6 進(jìn)化樹的建立 將Adk、Ppa、Gmk、nagC、Efp、atpG、recA基因連接，通過Mega6.0軟件完成進(jìn)化樹構(gòu)建，bootstrap設(shè)置為1000，使用的MS參考株信息見表2。

表2 MS參考株信息Tab 2 Information of MS reference strains

續(xù)表

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離、純化、鑒定結(jié)果 根據(jù)支原體菌落在固體培養(yǎng)基上呈“煎蛋狀”的特征，結(jié)合OIE推薦的PCR方法[3]，共分離到MS菌株54株，菌株詳細(xì)信息見表3。

表3 MS分離株ST分析結(jié)果Tab 3 ST analysis results of isolated strains

續(xù)表

2.2 MS分離株MLST分析結(jié)果 通過7個管家基因的等位基因定位，分離株的每個基因都包含3-5種類型(表4)，ST型可分為9種(表3)，其中以2種ST型為主，分別是34(31，占57.4%)、93(13，占24%)，其余7種ST型較少，分別為44(1)、95(1)、96(1)、102(1)、103(1)、148(4)、153(1)。

表4 管家基因的種類和數(shù)量Tab 4 The type and quantity of housekeeping genes

2.3 MS分離株遺傳進(jìn)化樹的建立 將中國MS分離株建立進(jìn)化樹，通過進(jìn)化關(guān)系可分為A～I(xiàn)類，進(jìn)化樹如圖1所示。

圖1 中國MS分離株進(jìn)化樹Fig 1 Phylogenetic tree of MS isolated strains from China

2.4 世界MS分離株遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建 將分離株與國內(nèi)外參考株構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)，可發(fā)現(xiàn)分離株具有很強(qiáng)的地域性。所有菌株可分為亞洲株(中國株和西亞株)、歐洲株、北美株(NA-1、NA-2、NA-3)和其它株。其它株包含Others-1和Others-2，其中Others-1包含大洋洲(澳大利亞)、歐洲(意大利、匈牙利、西班牙)、北美洲(美國)和南美洲(巴西)等5個洲的分離株；Others-2包含亞洲(中國、黎巴嫩)、歐洲(匈牙利)、北美洲(美國)等3個洲的分離株。

圖2 各國MS分類進(jìn)化樹Fig 2 MS classification phylogenetic tree of each country

3 討 論

MS呈全球性分布，近年來包括中國在內(nèi)的很多國家，MS爆發(fā)越來越頻繁，引起了國內(nèi)外科研工作者和養(yǎng)禽業(yè)的重視。針對2010-2015年的MS流行情況，馬爽等[4]采用平板凝集方法對華北、華中、華南、華東、西北和東北地區(qū)11個省份的雞場進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，表明均有MS感染，且抗體陽性率達(dá)30.23%～54.67%。Sun S等[5]對來源于16個省份的雞血清進(jìn)行檢測，抗體陽性率高達(dá)63%，10周齡后的雞陽性率最高。Xue J等[6]對中國21個省未接種疫苗的雞群進(jìn)行檢測，總血清陽性率為41.19%。2018年，羊揚[7]對廣西省3個黃羽肉雞公司的雞群血清進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示群內(nèi)抗體陽性率均高于80%。可見MS在我國廣泛流行，情況不容樂觀。

MS目前只有一種血清型，過去十幾年常用N Jeffery等[8]設(shè)計的方法，即采用VlhA基因5’端的保守區(qū)進(jìn)行基因分型，可將MS分為A～J等10種類型，是一種簡單、經(jīng)濟(jì)的分型方式，適用于初步研究。Sun等[9]首次在中國發(fā)現(xiàn)新的K型基因，中國特有且該基因型屬于中國最主要的基因型。謝迪等[1]采用VlhA基因?qū)?016-2019年我國部分地區(qū)的48株MS分離株進(jìn)行了分型，46株屬于K型，1株屬于A型，1株屬于E型，進(jìn)化樹結(jié)果顯示K型分支單一，基因亞型區(qū)分性差。

MLST分型采用了7對管家基因Adk、Ppa、Gmk、nagC、Efp、atpG、recA，等位基因包含的種類數(shù)量分別是29、36、44、25、29、66、41，種類豐富。世界上已鑒定的ST型達(dá)164種之多，中國分離株的ST型有23種，分別為34、90～104、145、147、148、151～154。MLST分型方法可以很好的區(qū)分不同的MS亞群，有利于MS的溯源和傳播規(guī)律研究。本研究采用MLST方法將54株MS分離株進(jìn)行測序分型。54個分離株包含9種ST型，其中34(31，占57.4%)、93(13，占24%)屬于優(yōu)勢基因型，與謝迪等[1]研究基本一致。

統(tǒng)計至2021年10月，MS的MLST序列有275份，ST型有164種。其中，主要國家為中國、美國、匈牙利和意大利4國，占總MS菌株的85%(235/275)以上。本研究將MS分離株依據(jù)進(jìn)化關(guān)系和地域分為亞洲株(中國株和西亞株)、歐洲株、北美株(NA-1、NA-2)和其它株(Others-1和Others-2)。Others-2是以MS經(jīng)典株WVU為代表的分支，包含了亞洲的中國、黎巴嫩，北美洲的美國和歐洲的匈牙利，共3個洲4個國家的分離株，分離株數(shù)量很少，但在2013-2019年均有分離，因此可推斷它是MS較原始的基因型，也有可能是因為種禽引進(jìn)引起的跨地域傳播。在圖2中Others-1分支上，可看到澳大利亞MS-H分離株、非洲的突尼斯分離株IZSVE/6077/D12/1以及美國的MS2143分離株,在進(jìn)化樹上與部分歐洲分離的菌株相近，地緣關(guān)系遠(yuǎn)，可能與人類的交流活動有關(guān)。由以上數(shù)據(jù)可見，MS流行的地域性比較強(qiáng)，只有少量交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

本研究將國內(nèi)的MS分離株通過進(jìn)化樹的形式進(jìn)行了分型，可分為A～I(xiàn)共9種類型。雖然全球范圍內(nèi)MS分離株的地域性很強(qiáng)，但是在國內(nèi)各省的地域分布上相關(guān)性不強(qiáng)。國內(nèi)主要流行的是E類，其次是A、B、H類。C類、D類與其它分離株進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn)，很少被分離到。F和G類是2019年后新分離的新菌株，與基因E型相近。關(guān)于近年MS爆發(fā)的主要原因，有觀點認(rèn)為是近年來種禽引進(jìn)引起，也有觀點認(rèn)為是養(yǎng)雞行業(yè)的快速無序擴(kuò)張所致，根據(jù)本研究結(jié)果可推測本地MS菌株很早就存在。因此，對MS的綜合防控需要對種源進(jìn)行凈化，并提升飼養(yǎng)管理水平，加強(qiáng)生物安全措施，同時采用藥物和疫苗聯(lián)合防控。