張 敏，李 建，舒金秀，馮超林，石寶蘭，鄭良益，牟林琳，柏 嬌， 胡玉立，徐 松，劉國興，閔娟娟，石 瑛，顧素云，謝紅玲*

(1.國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司，武漢 430075；2. 湖北省獸藥監(jiān)察所，武漢 430070)

犬瘟熱(Canine distemper， CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus， CDV)引起的一類在多種肉食性犬類(尤其是幼仔)、貂類等動物中急性高度接觸性、致死性傳染病，同時可感染非人靈長類動物[1]。該病廣泛分布全球，且各季節(jié)均有發(fā)生。根據(jù)臨床癥狀可分急性和慢性期，常引起劇烈的如結(jié)膜炎、腸胃炎等炎癥反應(yīng)和各種慢性神經(jīng)癥狀[2]，感染動物死亡率高達(dá)80%[3]。犬瘟熱已成為阻礙寵物飼養(yǎng)業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)等發(fā)展的主要疫病之一。由于缺乏簡便快捷、準(zhǔn)確、便于操作的檢測方法，常常延誤病機(jī)，錯過治療機(jī)會，導(dǎo)致動物死亡[4]。因此，開展對于CDV感染早期臨床診斷檢測研究具有重要意義。

CDV為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組6個開放閱讀框分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)，其中核衣殼蛋白在病毒裝配、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中起重要作用，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)[5-6]。核衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)核心和功能核心高度保守，是保守性較強(qiáng)的免疫原性蛋白，為單克隆抗體、膠體金檢測試紙條的研制等研究提供必要條件[7]。

目前CDV檢測方法包括病毒學(xué)診斷、電鏡顯微鏡診斷、病毒分離與鑒定[8]、免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)等多種檢測手段，免疫膠體金試紙條檢測技術(shù)無疑是最為簡便、快捷、高效、靈敏的病毒診斷方法，不受環(huán)境及人員限制，無需儀器設(shè)備輔助，對于動物感染的早期診斷及控制具有重要意義[9]。本研究用原核表達(dá)的N蛋白，免疫小鼠制備單克隆抗體，建立一種敏感性、特異性良好的免疫膠體金試紙條檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒種、細(xì)胞和其他試劑 SP2/0細(xì)胞、表達(dá)載體pET-28a、Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、F81細(xì)胞、BHK細(xì)胞、CDV(YD株、Snyder Hill株、WH-G株)、犬細(xì)小病毒(canine parvovirus, CPV)、犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2, CAV2)、狂犬病病毒(rabies virus, RV)為國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司保存；FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司；HAT、HT，Sigma公司；單抗亞類鑒定試劑盒，洛陽賽爾維公司。安捷犬瘟熱病毒抗原快速檢測試紙，購自韓國安捷公司，貨號RG1103DF。

1.2 CDV N蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)純化

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的CDV N全基因序列，設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物，預(yù)期擴(kuò)增片段為1572 bp。引物序列如下：

CDV-NF：5′-GGTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGGCTAGCCTTCTCAAGAG -3′ (NdeI)

CDV-NR：5′-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATTAAGTAGCTCTCTATCATTATA-3′ (XhoI)

1.2.2 CDV中N基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 參照RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA并以其為模板，按上述引物擴(kuò)增CDV的N基因。RT-PCR 的反應(yīng)參數(shù)是：98 ℃預(yù)熱2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火溫度15 s，72 ℃延伸2 min(從第二步98 ℃變性到第四步72 ℃延伸進(jìn)行35個循環(huán))，72 ℃延伸10 min?；厥占兓腜CR產(chǎn)物經(jīng)NdeI和XhoI酶切后克隆至pET-28a載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.3 重組CDV N蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

將pET-28a-N轉(zhuǎn)化至受體菌BL21，待OD600達(dá)到0.4～0.5時，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將BL21誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物離心取菌體進(jìn)行超聲破碎，破碎后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。表達(dá)的上清過Ni柱進(jìn)行純化，分別收集流穿液和各洗脫峰，并將各樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將純化后的CDV N蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加入合適稀釋倍數(shù)的陽性兔血清作一抗，用羊抗兔IgG-HRP為二抗，進(jìn)行Western Blotting鑒定。

1.3 單克隆抗體的研制

1.3.1 動物免疫 將CDV N蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合并完全乳化后，小鼠腹股溝兩側(cè)靠近淋巴結(jié)區(qū)和頸部皮下多點(diǎn)免疫，每只50 μg/0.5 mL，21 d后2免，免疫劑量為首次免疫的一半，佐劑用弗氏不完全佐劑，間隔21 d后3免，免疫劑量和佐劑同2免，10 d之后采用腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量同首免，3 d后融合。

1.3.2 細(xì)胞融合 按照常規(guī)方法無菌采取小鼠的脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞按10∶1比例混合，用PEG1450進(jìn)行融合，將融合之后的細(xì)胞加入鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞株篩選 利用間接ELISA法和間接免疫熒光法對所培養(yǎng)的雜交瘤上清進(jìn)行檢測，有限稀釋法對檢測陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行至少三次以上的克隆直至陽性率為100%為止。

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 腹水的生產(chǎn)及其純化 選擇12周齡以上的雌性BALB/C小鼠，腹腔注射單克隆雜交瘤細(xì)胞，7 d之后收取小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水。

1.4.2 單克隆抗體的亞類測定 按照洛陽賽爾維公司單抗亞類試劑盒說明書進(jìn)行單克隆抗體亞類的測定。

1.4.3 單克隆抗體敏感性鑒定 將不同CDV株(YD株、Snyder Hill株、WH-G株)分別接種長滿單層的Vero細(xì)胞的96孔板中，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)72 h后用冷丙酮固定；以CDV N蛋白單克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測，于熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.4.4 單克隆抗體特異性鑒定 將CDV、CPV、CAV2、RV分別接種長滿單層的Vero細(xì)胞、F81細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、BHK細(xì)胞的96孔板中，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)72 h后用冷丙酮固定；以CDV N蛋白單克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測，于熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 免疫膠體金試紙條的制備及檢測

1.5.1 CDV膠體金快速檢測試紙條的制備 用檸檬酸三鈉還原法制備25 nm的金顆粒溶液，標(biāo)記量為30 μg/mL膠體金溶液的單克隆抗體D3，攪拌30 min，在加入終濃度20%的PEG 20000穩(wěn)定未結(jié)合的膠體金顆粒，8700 r/min離心30 min，棄上清，再用金標(biāo)緩沖溶液定容至2 mL。標(biāo)記好的膠體金溶液均勻涂布于金標(biāo)墊上，37 ℃烘干2 h備用。再將羊抗小鼠IgG二抗和單克隆抗體D6分別以1 mg/mL濃度包被硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線和檢測線，37 ℃烘干2 h備用。將準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜、樣品墊、金標(biāo)墊和吸水紙按順序粘貼到背襯板上，切條機(jī)切割成4 mm條，組裝成檢測試紙條。

1.5.2 CDV膠體金快速檢測試紙條檢測

1.5.2.1 試紙條對不同毒株CDV的敏感性檢測 將Snyder Hill株和WH-G株進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200系列稀釋，YD株進(jìn)行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40系列稀釋；加樣量均為0.1 mL/孔，分別用本試紙條進(jìn)行檢測，評判試紙條檢測敏感性。

1.5.2.2 試紙條特異性檢測 取CPV、CAV2、RV、CDV陰性對照樣品，分別用本試紙條進(jìn)行檢測，評判試紙條特異性。

1.5.3 臨床試驗(yàn)樣本適用性試驗(yàn)及對比試驗(yàn)

分別用本研究制備試紙條、安捷試紙條及PCR擴(kuò)增法檢測50份犬鼻液或眼分泌物樣品，具體參照《犬瘟熱病毒病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 27532-2011)，計(jì)算本研究試紙條與安捷試紙條、PCR檢測方法的符合率。

符合率=結(jié)果符合的樣品數(shù)/總樣品數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 CDV重組N蛋白表達(dá)及鑒定

2.1.1 CDV N基因的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增出CDV N蛋白基因片段，電泳檢測結(jié)果(圖1)顯示，目的基因CDV N蛋白基因片段長度為1572 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

1-6：CDV N基因；M：Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker1-6：CDV N gene；M：Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker圖1 CDV N基因PCR擴(kuò)增圖Fig 1 The PCR results of CDV N gene

2.1.2 CDV N蛋白表達(dá)、純化及鑒定 原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)CDV N蛋白，菌體破碎后上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)顯示，表達(dá)純化后的N蛋白分子量大小在58 kD 附近，大量存在于破碎后的上清液中。上清液純化后雜蛋白被去除，可見明顯單一目的蛋白條帶(圖3)。同時將純化后的N蛋白進(jìn)行Western Blotting鑒定，N蛋白樣品孔出現(xiàn)一條與目的蛋白大小相同的條帶，表明純化后的N蛋白反應(yīng)原性良好(圖4)。

1：菌體破碎后上清；2：菌體破碎后沉淀；M：PageRuler非預(yù)染蛋白Marker1：Supernatant after induction；2：Supernatant of the bacteria lysate after induction；M：PageRuler unstained protein ladder圖2 CDV N蛋白表達(dá)各成分鑒定圖Fig 2 Identification of CDV N protein

1：CDV N蛋白純化前；2：流穿雜蛋白樣；3-9：各洗脫時間段收獲CDV N蛋白樣；M：PageRuler非預(yù)染蛋白Marker1：Unpurified CDV N protein；2：Impure protein；3-9：Purified CDV N protein；M：PageRuler unstained protein ladder圖3 CDV N蛋白柱純化鑒定圖Fig 3 Identification and purification of CDV N protein

1：陰性對照；2：CDV N蛋白；M：PageRuler預(yù)染蛋白Marker1：Negative control；2：Purified CDV N protein；M：PageRuler prestained protein ladder圖4 CDV N蛋白純化Western blotting鑒定圖Fig 4 Western blotting identification of purified CDV N protein

2.2 單克隆抗體研制及鑒定 共篩選2株分泌CDV N蛋白抗體單克隆雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為D3和D6。

2.2.1 單克隆抗體亞類測定 D3、D6亞類均為IgG1。

2.2.2 腹水的純化 純化抗體D3、D6進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析，結(jié)果見圖5，2株單克隆抗體均出現(xiàn)大小50 kD左右的重鏈和25 kD左右的輕鏈，且雜蛋白去除較好，單抗純凈度較高。

1：D3單抗；2：D6單抗；M：PageRuler非預(yù)染蛋白Marker1：Monoclonal antibody D3；2：Monoclonal antibody D6；M：PageRuler unstained protein ladder圖5 CDV N蛋白單抗純化SDS-PAGE鑒定圖Fig 5 SDS-PAGE identification of purified McAbs against CDV N protein

2.2.3 單克隆抗體敏感性鑒定 D3、D6單克隆抗體均能與不同CDV株(YD株、Snyder Hill株、WH-G株)感染的Vero細(xì)胞反應(yīng)，可見明顯綠色熒光，與陰性細(xì)胞無熒光,說明D3、D6單克隆抗體敏感性良好，能識別結(jié)合多株CDV(圖6、圖7)。

A：感染CDV-YD株細(xì)胞孔；B：感染CDV-Snyder Hill株細(xì)胞孔；C：感染CDV- WH-G株細(xì)胞孔；D：正常細(xì)胞對照A：Infected CDV-YD；B：Infected CDV-Snyder Hill；C：Infected CDV- WH-G；D：Negative control圖6 單克隆抗體D3敏感性鑒定(×40)Fig 6 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding sensitivity of antibody D3(×40)

A：感染CDV-YD株；B：感染CDV-Snyder Hill株；C：感染CDV- WH-G株；D：正常細(xì)胞對照A：Infected CDV-YD；B：Infected CDV-Snyder Hill；C：Infected CDV- WH-G；D：Negative control圖7 單克隆抗體D6敏感性鑒定(×40)Fig 7 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding sensitivity of antibody D6(×40)

2.2.4 單克隆抗體特異性鑒定 D3、D6單克隆抗體均能與感染CDV的Vero細(xì)胞反應(yīng)，可見明顯綠色熒光，與陰性細(xì)胞無熒光。與感染CPV、CAV2、RV的細(xì)胞均不發(fā)生特異性反應(yīng)，無熒光信號，說明D3、D6單克隆抗體僅與CDV發(fā)生特異性反應(yīng)，與CPV、CAV2、RV均不結(jié)合，單克隆抗體特異性良好(圖8、圖9)。

A：感染CDV；B：感染CPV；C：感染CAV2；D：感染RV；E：正常細(xì)胞對照A：Infected CDV；B：Infected CPV；C：Infected CAV2；D：Infected RV；E：Negative control圖8 單克隆抗體D3特異性鑒定(×40)Fig 8 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding specificity of antibody D3(×40)

A：感染CDV；B：感染CPV；C：感染CAV2；D：感染RV；E：正常細(xì)胞對照A：Infected CDV；B：Infected CPV；C：Infected CAV2；D：Infected RV；E：negative control圖9 單克隆抗體D6特異性鑒定(×40)Fig 9 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding specificity of antibody D6(×40)

2.3 免疫膠體金試紙條檢測方法的敏感性及特異性

2.3.1 試紙條檢測敏感性 本試紙條檢測不同CDV株，檢測105.3TCID50/mL的YD株病毒液，1∶5、1∶10稀釋度檢測結(jié)果均為陽性，1∶20、1∶40稀釋度檢測結(jié)果為陰性；檢測106.5TCID50/mL的Snyder Hill株和WH-G株病毒液，1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋度檢測結(jié)果均為陽性，1∶800、1∶1600、1∶3200稀釋度檢測結(jié)果為陰性(圖10)。本試紙條檢測不同株CDV的最低限均為1000 TCID50，敏感性良好。

A：YD株；B：Snyder Hill株；C：WH-G株A：YD；B：Snyder Hill；C：WH-G圖10 試紙條敏感性結(jié)果Fig 10 Sensitivity test of dipstick

2.3.2 試紙條檢測特異性 本試紙條檢測CPV、CAV2、RV、CDV陰性對照，結(jié)果均為陰性，表明該試紙條不與犬其他常見病毒反應(yīng)，特異性良好，檢測結(jié)果見圖11。

1：CPV；2：CAV2；3：RV；4：陰性對照1：CPV；2：CAV2；3：RV；4：Negative control圖11 試紙條特異性檢測結(jié)果Fig 11 Specificity test of dipstick

2.4 試紙條臨床適用性及同類產(chǎn)品、PCR法符合率 檢測臨床犬鼻液或眼分泌物樣品50份，其中陽性樣品16份，陰性樣品34份，陽性率為32%。安捷試紙條檢測陽性結(jié)果17份，陰性結(jié)果33份。兩種試紙條的檢測符合率為98%。PCR檢測陽性結(jié)果17份，陰性結(jié)果33份。本試紙條與PCR檢測符合率為98%。各檢測結(jié)果見表1。

表1 臨床試驗(yàn)檢測結(jié)果Tab 1 Clinical test

3 討論與小結(jié)

CDV自然感染的宿主范圍廣泛，造成的危害及經(jīng)濟(jì)損失逐步擴(kuò)大，以幼犬最為易感。目前實(shí)驗(yàn)室診斷雖快速高效、特異性強(qiáng)，但常用的RT-PCR法、電鏡法等對人員的專業(yè)技術(shù)和儀器設(shè)備要求較高。基于單克隆抗體和免疫膠體金技術(shù)構(gòu)建的檢測方法完美地規(guī)避上述難題，提供一種可現(xiàn)場檢測、操作簡單、結(jié)果直觀可見的診斷方法[9-10]。犬瘟熱膠體金試紙條為目前寵物醫(yī)院等臨床用于CDV檢測中使用最廣泛的檢測方法，但主要存在的問題為敏感性較低，為解決該問題，高敏感性單克隆抗體的研制顯得尤為關(guān)鍵[11-12]。使用CDV全“+”為陽性，“‐”為陰性病毒研發(fā)的單克隆抗體，應(yīng)用于試紙條產(chǎn)品較為常見[13]，但存在不同來源的病毒株檢測敏感性低、假陽性、特異性不強(qiáng)等問題[14-15]。區(qū)別于傳統(tǒng)的試紙條研發(fā)，本研究專注于開發(fā)針對CDV亞單位的單克隆抗體并進(jìn)行試紙條的研發(fā)，能較大幅度地提高試紙條檢測方法的敏感性及特異性。CDV N蛋白結(jié)構(gòu)及功能高度保守，以其作為免疫抗原得到的單克隆抗體，構(gòu)建膠體金試紙條檢測方法，靈敏性特異性強(qiáng)[16]。本研究研制的CDV膠體金檢測試紙條有很好的臨床適用性，與目前寵物診所廣泛使用的韓國安捷公司生產(chǎn)的CDV抗原快速檢測試紙對比有較高的符合率，為臨床快速診斷CDV提供參考方法，同時降低了動物診所的使用成本。

本研究成功構(gòu)建了CDV N蛋白原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)，純化獲得免疫原性良好的CDV N蛋白。應(yīng)該雜交瘤技術(shù)，成功篩選到2株敏感性及特異性良好的單克隆抗體D3、D6，可識別不同CDV株(YD株、Snyder Hill株、WH-G株)。以此單抗為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建免疫膠體金試紙條檢測方法，實(shí)驗(yàn)室檢測證實(shí)能有效區(qū)分CDV、CPV、CAV2、RV，特異性良好。本研究研制的CDV檢測試紙條，在臨床應(yīng)用方面仍需進(jìn)一步研究完善，臨床樣本(口鼻、眼結(jié)膜分泌物)雜質(zhì)多[17]，檢測方法需進(jìn)一步優(yōu)化驗(yàn)證。